青蛤(Cyclina sinensis) TRAF6基因克隆及其在Poly I：C胁迫下的免疫应答*

高玮玮　潘宝平　闫春财①

(1. 天津市河西区职工大学　天津　300203; 2. 天津师范大学生命科学学院　天津市动植物抗性重点实验室　天津　300387)

青蛤(Cyclina sinensis)是我国近海重要的经济软体动物。近年来,海水贝类养殖业中各种病害的爆发严重制约着行业的健康发展。因此,开展软体动物先天性免疫识别路径方面的研究尤为重要,能够为其免疫学理论及病害防治措施提供有价值的实验数据。

软体动物具有非特异性的先天免疫系统,其Toll样受体(TLRs),是一类很重要的模式识别受体,能够识别细菌、真菌、原生动物以及病毒等病原体的侵染(Akiraet al,2006)。有研究表明,TLR3可以识别双链RNA(dsRNA)的类似物,聚肌苷-脱氧胞苷酸(Poly I:C)(Yamamotoet al,2003),TLR3缺陷型的小鼠还对巨细胞病毒呈易感性(Tabetaet al,2004)。肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)是衔接 Toll样/白细胞介素 1受体(Toll/IL-1 receptor,TIR)超家族以及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor)超家族的重要分子。目前在哺乳动物中已经发现的 TRAFs家族成员有 7个(TRAF1-7)。Ishida等(1996)通过酵母双杂交对于CD40信号传导作用的研究时,发现了能与 CD40作用的TRAF6。其分子包括C端的指环型锌指结构,两个TRAF型锌指结构,N端的coiled-coil结构域以及MATH(Meprin and TRAF homology)结构域。TRAF6是衔接Toll样/白细胞介素1受体(Toll/IL-1 receptor,TIR)超家族以及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor)超家族的重要分子,在动物机体的脑、心脏、肝、骨骼肌、肾脏、脾脏等组织中均能表达。

1　材料与方法

1.1　材料

青蛤样品采于天津大港海域,选取成体、形态无显著差异的个体[平均壳长(29.14±1.23)mm,平均壳宽(19.12±0.57)mm,平均壳高(29.52±1.47)mm]。实验前在通气海水中暂养,海水密度 1.02—1.04g/cm3,水温21—24℃,pH 7.0,投喂5‰小球藻,一周后进行实验。

1.2　方法

1.2.1青蛤转录组文库的构建及数据筛选采用Trizol法提取活体青蛤各组织总RNA,采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits方法进行分离纯化。采用Illumina MiSeq二代测序仪完成转录组测序。对Unigene进行 Pathway通路的注释和预测(Panet al,2015),从中筛选得到青蛤TRAF6(Cs TRAF6)基因的类似序列。

1.2.2侵染实验实验所用 Poly I:C浓度为1μg/g。 利用随机分组方法选取对照组和实验组,每组设置10个平行试验。在实验组青蛤的闭壳肌内注射50μL Poly I:C悬液,对照组注射等量灭菌海水。注射前准确称取青蛤闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏各 50mg,迅速放入液氮中,在预冷匀浆器中按质量体积比 1∶9加入预冷生理盐水进行匀浆,4°C,4500r/min离心 15min,取上清备用。分别于注射后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h 提取血淋巴,4°C,8000r/min离心10min,收集血细胞,加入1mL Trizol,于–80°C超低温冰箱冷冻备用。

1.2.3生物信息学分析利用筛选得到的青蛤CsTRAF6基因类似序列设计引物 Cs TRAF6-S、CsTRAF6-A (表1)并克隆,测序后与GenBank核酸数据库进行BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析;ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ gorf/)预测开放阅读框(ORF); 利用 ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)在线分析蛋白质性质; 使用ProtParam分析预测蛋白质的理论分子量以及等电点;SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)查找蛋白质结构域; 使用 ClustalX1.83对氨基酸序列进行比对,并根据邻接法(NJ),使用MEGA4.1构建基因的物种进化树,采用bootstrap1000个循环检验拓扑结构的置信度。

1.2.4CsTRAF6基因在各组织内的表达分析参考(魏星等,2015)方法,将青蛤闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏的上清液与注射 0h的血细胞分别置于1mL TRIZOL中用于提取总RNA,根据TaKaRa公司的PrimerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA,以cDNA为模板,β-actin基因为内参基因进行实时荧光定量PCR。根据β-actin基因和克隆得到的 CsTRAF6基因序列分别设计引物: β-actin-F,β-actin-R,CsTRAF6-F,CsTRAF6-R (表 1)。反应在 iQ5荧光定量PCR仪上进行,扩增体系20μL,反应程序:95°C 预变性 30s,94°C 变性 5s,60°C 退火 30s,72°C延伸 30s,共 40个循环。数据的处理采用 2-ΔΔCT法(Livaket al,2001),数据分析利用SPSS软件进行。

表1　实验中用到的PCR引物Tab.1　PCR primer sequences used in this study

1.2.5Poly I:C侵染后青蛤血淋巴CsTRAF6基因的时序性表达分别在注射后 0h、3h、6h、12h、24h、48h提取青蛤血淋巴细胞总 RNA,方法及引物同1.2.4。反应程序: 95°C 预变性 30s,95°C 变性 5s,58°C退火30s,72°C延伸30s,共40个循环。数据的处理采用 2-ΔΔCt法,使用 SPSS软件对相同时间点实验组及对照组,实验组及空白组的表达量进行单因素方差分析。

2　结果

2.1　CsTRAF6基因的序列分析

青蛤CsTRAF6基因的ORF为2337bp,能够编码出含有778个氨基酸的多肽。该多肽的估计分子量为86.59kDa,估计等电点为6.16。通过SMART在线分析表明CsTRAF6编码的氨基酸包含RING型锌指结构(183—221aa),两个TRAF型锌指结构(266—320aa,320—377aa),coiled-coil 结构域(592—624aa)以及MATH结构域(629—756aa)(图 1)。CsTRAF6基因在GenBank中的注册号为KP067203。

2.2　CsTRAF6基因的系统进化分析

利用BLASTP比对表明,青蛤CsTRAF6基因的氨基酸与栉孔扇贝 TRAF6基因的同源性最高,达到60%。与霸王花青螺Lottia giganteanTRAF6 (XP_009051677.1)、虾夷扇贝TRAF6基因氨基酸序列同源性分别为56%和48%。利用16个物种的TRAF6基因(图2)构建的系统树表明,不同物种的TRAF6基因各自聚成一支,其中哺乳动物与软体动物的 TRAF6基因明显的聚在两个分支上,青蛤 CsTRAF6基因与其它软体动物的TRAF6基因聚在一支。果蝇、对虾的TRAF6基因分别独立聚成一支。刺参与文昌鱼的TRAF6基因聚在一个分支上。由此可见,青蛤CsTRAF6基因的分子生物学特性与软体动物在分类学上的进化地位的一致性。

图1　青蛤TRAF6的开放阅读框及结构域Fig.1　The open reading frame and the structural domain of CsTRAF6

2.3　CsTRAF6基因在组织间的表达分析

以青蛤β-actin基因作为内参对照,运用Real-time PCR方法检测青蛤CsTRAF6在血淋巴、闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏中的表达量(图 3)。结果显示,CsTRAF6在青蛤的六种组织中均能够表达,而在血淋巴中的表达水平最高,在闭壳肌中的表达水平次之,在肝脏的表达量最低。

图2　利用邻接法(NJ)建立的16个物种的TRAF6基因氨基酸序列系统进化树Fig.2　Phylogenetic tree of the amino acid sequences of TRAF6 from 16 species constructed using the Neighbor Joining method

图3　CsTRAF6基因的组织分布表达Fig.3　Tissues distribution of CsTRAF6

2.4　CsTRAF6基因在Poly I：C刺激下的表达分析

青蛤在Poly I:C侵染后,不同时间点的血淋巴中CsTRAF6基因相对于β-actin基因的表达变化如图4所示。结果显示,实验组的表达量在侵染后的 3h时迅速升高; 表达量在 6h时达到最大值,与对照组相比差异显著(P＜0.05),约为对照组的3.8倍,并且显著高于空白组(P＜0.05)。6h后其表达量开始下降,逐渐恢复至正常水平。

图4　Poly I:C感染后青蛤CsTRAF6基因的相对表达量Fig.4　Relative expression of CsTRAF6 in C. sinensis after infection with Poly I:C

3　讨论

通过青蛤转录组文库筛选得到的青蛤 CsTRAF6基因的类似序列,经克隆及二次测序后,通过BLAST核苷酸数据库进行比对获得了青蛤CsTRAF6的cDNA序列,其ORF为2337bp,能够编码778个氨基酸的蛋白质。预测的CsTRAF6蛋白估计分子量为86.59kDa,估计等电点为6.16。通过SMART在线分析CsTRAF6基因编码的氨基酸序列包含RING型锌指结构(183—221aa),两个 TRAF型锌指结构(266—320aa,320—377aa),coiled-coil结构域(592—624aa)以及MATH结构域(629—756aa)。这些结构域在青蛤中是保守的,表明它们具有与哺乳动物TRAF6s 基因类似的功能。相关研究表明,N端RING型锌指结构与 TRAF型锌指结构用于激活 IKK(Grechet al,2000),coiled-coil结构域的作用是自动泛素化从而激活下游 NF-κB信号通路(Yanget al,2004)。此外,MATH结构域能够与通路上游信号分子IRAK相互作用(Archet al,1998)。

通过BLASTP比对表明青蛤CsTRAF6的氨基酸与栉孔扇贝 TRAF6的同源性最高,达 60%。与霸王花青螺、虾夷扇贝TRAF6氨基酸序列同源性为56%和 48%。通过 MEGA构建的系统树表明,不同物种的TRAF6基因各自聚成一支,青蛤CsTRAF6基因与其它软体动物的 CsTRAF6基因聚在一支,脊椎动物的TRAF6基因聚在其它分支上。黑腹果蝇的TRAF6基因氨基酸序列单独在一个分支上。结果表明,青蛤CsTRAF6基因与软体动物TRAF6基因进化距离较近,相反与昆虫以及脊椎动物的TRAF6基因的进化距离较远,因此,CsTRAF6基因可能是TRAF6家族的一个新成员。

本研究中利用Real-time PCR方法检测其在各个组织中的表达情况。结果显示,青蛤 CsTRAF6基因在所有的组织中普遍表达,表明其参与多种生物学过程。青蛤像其它双壳类软体动物一样,有一个开放的循环系统,其体内的血液渗透压和温度会随着环境而波动。这个开放的血液循环体系对于无脊椎动物的免疫防御有关键的作用(Bigaset al,2006)。它们可以充当吞噬细胞以及参与体液因子的分泌。CsTRAF6基因在血淋巴中的表达量最高,这与虾夷扇贝TRAF6的表达情况相似(Heet al,2013),这表明CsTRAF6可能在抵御病原物质感染时发挥着重要作用。然而这与栉孔扇贝TRAF6(CfTRAF6)基因在组织中的表达情况不同,其CfTRAF6主要在性腺中表达,表明CfTRAF6基因在扇贝的发育过程中起着重要作用。上述结果表明CsTRAF6在青蛤体内主要起到免疫作用,亦说明不同种类软体动物的 TRAF6基因在组织中的表达模式及调节功能有明显差别。

前人相关研究认为,低等动物血液可以直接吞噬和破坏微生物(Sunet al,2001),而软体动物的先天免疫系统主要依靠血淋巴的循环运转(Pipeet al,1997;Woottonet al,2003)。在脊椎动物中,TLR3是通过识别双链 RNA以及合成类似物如 Poly I:C,随后引发MyD88非依赖性途径,从而引起干扰素的分泌(Alexopoulouet al,2001)。TRAF6是Toll样受体信号通路中重要的信号转导分子,本研究中的 CsTRAF6基因在 Poly I:C的刺激下,其表达量在侵染后的 3h便迅速升高,说明CsTRAF6基因参与了对于Poly I:C刺激的免疫应答反应,并且青蛤内存在于TLR3所介导的信号通路,有关该通路在青蛤体内所发挥的免疫功能还需进一步探索。

魏星,张海静,潘宝平,2015. 青蛤(Cyclina sinensis)IκB 基因的克隆及其在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达分析. 海洋与湖沼,46(4): 793—799

Akira S,Uematsu S,Takeuchi O,2006. Pathogen recognition and innate immunity. Cell,124(4): 783—801

Alexopoulou L,Holt A C,Medzhitov Ret al,2001. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-κB by Toll-like receptor 3. Nature,413(6857): 732—738

Arch R H,Gedrich R W,Thompson C B,1998. Tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs)-a family of adapter proteins that regulates life and death. Genes Dev,12:2821—2830

Bigas M,Durfort M,Poquet M,2006. Cytological response of hemocytes in the European flat oyster,Ostrea edulis,experimentally exposed to mercury. Biometals,19(6):659—673

Grech A,Quinn R,Srinivasan Det al,2000. Complete structural characterisation of the mammalian andDrosophilaTRAF genes: implications for TRAF evolution and the role of RING finger splice variants. Mol Immunol,37(12—13):721—734

He C B,Wang Y,Liu W Det al,2013. Cloning,promoter analysis and expression of the tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) in Japanese scallop(Mizuhopecten yessoensis). Mol Biol Rep,40(8):4769—4779

Ishida T,Mizushima S I,Azuma S,et al,1996. Identification of TRAF6,a novel tumor necrosis factor receptor-associated factor protein that mediates signaling from an aminoterminal domain of the CD40 cytoplasmic region. J Biol Chem,271(46): 28745—28748

Livak K J,Schmittgen T D,2001. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethods. Methods,25: 402—408

Pan B P,Ren Y P,Gao Jet al,2015.De novoRNA-Seq analysis of the venus clam,Cyclina sinensis,and the identification of immune-related genes. PLoS One,10(4): e0123296

Pipe R K,Farley S R,Coles J A,1997. The separation and characterisation of haemocytes from the musselMytilus edulis. Cell Tissue Res,289(3): 537—545

Sun H S,Li G Y,2001. Humoral factors of bivalves participating in immunity defence. Marine Sciences,25(4): 34—36

Tabeta K,Georgel P,Janssen Eet al,2004. Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of innate immune defense against mouse cytomegalovirus infection. Proc Natl Acad Sci USA,101(10): 3516—3521

Wootton E C,Dyrynda E A,Ratcliffe N A,2003. Bivalve immunity:comparisons between the marine mussel (Mytilus edulis),the edible cockle (Cerastoderma edule) and the razor-shell (Ensis siliqua). Fish Shellfish Immunol,15(3): 195—210

Yamamoto M,Sato S,Hemmi Het al,2003. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science,301(5633): 640—643

Yang K,Zhu J M,Sun S Get al,2004. The coiled-coil domain of TRAF6 is essential for its auto-ubiquitination. Biochem Biophys Res Commun,324(1): 432—439