食用油中反式脂肪酸的气相色谱检测法研究

孙慧珍，曲赛男，裘立群，宋少芳山东农业大学化学与材料科学学院，山东泰安271018



食用油中反式脂肪酸的气相色谱检测法研究

孙慧珍，曲赛男，裘立群*，宋少芳*
山东农业大学化学与材料科学学院，山东泰安271018

摘要：食用油中反式脂肪酸的检测是控制其含量的先决条件。食用油样品经适当萃取剂处理后，利用正交试验法确立两步甲酯化条件，其中反式脂肪酸可顺利地转化为反式脂肪酸甲酯。两步甲酯化条件为：经0.4 mol·L-1氢氧化钠-甲醇中40℃下酯化30 min后，0.5 mol·L-1硫酸-甲醇中70℃下酯化50 min。在极性DB-23毛细管柱上利用三阶程序升温气相色谱法可分离、检测转化后的反式脂肪酸甲酯。三阶升温程序为：先在140℃时保持1 min，然后以10℃·min-1的速度升高至180℃，接着以2℃·min-1的速度升高至220℃，在220℃时保持20 min后再以5℃⋅min-1的速度升高至230℃，最后在230℃时保持16 min。本气相色谱法分析法能检测食用油中常见的8种反式脂肪酸，其线性相关性、检出限和回收率均能满足定性和定量分析的要求。

关键词：食用油；反式脂肪酸（FTA）；气相色谱法；两步甲酯化

反式脂肪酸（TFA）是一类含有反式构型双键的不饱和脂肪酸，是油脂和含油脂食物中常见的成分[1-3]。研究表明，反式脂肪酸对人体健康有一系列不利影响，过多食用会引起心血管疾病、糖尿病等。欧美各国都对食品中反式脂肪酸的含量作了限定。许多国家对反式脂肪酸进行了深入的研究，并采用各种方法检测食品中的反式脂肪酸含量。气相色谱分析法（GC）由于检测限低、灵敏度高成为目前检测脂肪酸的最为有效的方法之一。借鉴国标中食用油脂肪酸的气相色谱分析方法，反式脂肪酸的气相色谱分析的基本步骤也是先采用适合的萃取剂将食用油中的反式脂肪酸甘油三酯释放成游离脂肪酸，再进行衍生甲酯化处理后，再用GC进行检测[4]。因此，确立高效、简便的反式脂肪酸前处理过程和气相色谱分离条件是气相色谱法分析反式脂肪酸的两大重要任务。本实验首先通过设计正交实验对多种前处理方法包括萃取剂、酯化剂、酯化时间及温度等进行对比、优化，然后对色谱条件进行了摸索和数据统计分析，最终确定了简便而有效的食用油中反式脂肪酸检测方法。该方法能检测食用油中常见的8种反式脂肪酸，其线性相关性、检出限和回收率均能满足定性和定量分析的要求。

1　材料与方法

1.1仪器与材料

岛津GC-2010气相色谱分析仪，配备氢火焰离子化检测器（FID）及GCsolution2.3版工作站（日本株式会社岛津制作所）；CP-Sil 88毛细管色谱柱（100 m×0.25 mm ID，0.2 μm）、DB-23毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm i.d.，0.25 μm）（美国Agilent公司）；QL-300氢气发生器（山东赛克塞斯氢能源有限公司）；QL型纯净空气泵（山东赛克塞斯氢能源有限公司）；TGL-20M台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。

反式脂肪酸甲酯混合标准品：反式肉豆蔻酸甲酯（C14:1n9t）、反式棕榈油酸甲酯（C16:1n9t）、反式岩芹酸甲酯（C18:1n6t）、反式油酸甲酯（C18:1n9t）、反式异油酸甲酯（C18:1n11t）、反式亚油酸甲酯（C18:2n9t，12t）、反式二十碳烯酸甲酯（C20:1n11t）、反式二十二碳烯酸甲酯（C22:1n13t）（上海安谱实验科技股份有限公司）；甲醇（色谱纯，天津永大试剂公司）；氢氧化钠、硫酸等分别为国产分析纯；市售食用油。

1.2色谱检测条件

载气：高纯氮气，流速0.5 m·min-1；进样量：1.0 μL，分流比10:1，进样口温度：250℃；程序升温控制柱温；FID检测器：260℃，氢气流量40 mL·min-1，空气流量400 mL·min-1，尾吹流量30 mL·min-1。

1.3样品前处理

称取约0.05 g样品于20 mL具塞试管中，首先加入2 mL萃取剂，振荡30 min；然后加入2 mL酯化剂，充入高纯氮气密封，于设定温度水浴中恒温振摇反应一定时间。反应完成后水浴冷却，加入10 mL饱和食盐水进行淋洗，振荡后静置分层，收集上层有机相，再加入2 mL正己烷，重复萃取两次；后加入适量无水硫酸钠，离心，取1 mL上清液进行GC分析。处理液于-20℃下保存[5，6]。

样品前处理时，其中反式脂肪酸甲酯化反应越完全，反应产率就越高，GC分析结果就会越精确。故可用单一样品GC色谱图中相应反式脂肪酸甲酯的峰面积的大小表示甲酯化反应产率高低。

2　结果与讨论

2.1气相色谱条件的确定

2.1.1色谱柱的选择反式脂肪酸与顺式脂肪酸互为异构体，弱极性的色谱柱很难将两者分开，极性毛细管柱DB-23和CP-Sil 88是气相色谱法分析食用油脂肪酸常用的色谱柱[7]。DB-23（30 m×0.32 mm ID，0.25 μm）和CP-Sil 88（100 m×0.25 mm ID，0.2 μm）毛细管柱对8种反式脂肪酸甲酯混合标准品的GC分离色谱图见图1。

图1　8种反式脂肪酸甲酯标准品分别在DB-23细管柱（a）和CP-Sil 88毛细管柱（b）上的谱图Fig.1　The chromatogramsofeightkindsoftransfattyacid methyl estersbyDB-23capillary column（a）and CP-Sil88capillary column（b）Peaks: 1-C14:1n9t；2-C16:1n9t；3-C18:1n11t；4-C18:1n9t；5-C18:1n6t；6-C18:2n9t，12t；7-C20:1n11t；8-C22:1n13t

将混合标品与单一标品的色谱峰保留时间对比之后，依据碳数递增规律，确定了出峰顺序[8-11]。相同碳数的不饱和脂肪酸甲酯（如C18:1n6t、C18:1n9t、C18:1n11t、C18:2n9t，12t））烯键少的先出峰，即C18:1n6t、C18:1n9t和C18:1n11t应位于C18:2n9t，12t之前；同一异构体的不饱和脂肪酸（如C18:1n6t 和C18:1n9t），烯键碳数大的色谱峰比烯键碳数小的先出峰，即C18:1n9t位于C18:1n6t之前。比较图1中a和b可以看出，在相同色谱条件下，CP-Sil 88毛细管柱经过较长的分析时间能将C18:1n11t与C18:1n9t分开，但后者基线漂移比较严重。DB-23毛细管柱虽然无法将其分离，但对标样的响应值明显较高，并且实际中只需用到反式C18:1的总含量，最终确定的是总的TFA含量，因此采用分析时间较短的DB-23毛细管柱更适合对样品的中反式脂肪酸的测定。

2.1.2程序升温条件的优化实验比较了不同程序升温条件对反式脂肪酸甲酯的分离效果。较为合适的升温程序为：先在140℃时保持1 min，然后以10℃·min-1的升温速度升高至180℃，接着以2℃·min-1的升温速度升高至220℃，在220℃时保持20 min后以5℃·min-1的升温速度升高至230℃，最后在230℃时保持16 min。在此条件下，8种反式脂肪酸甲酯混合标准品的色谱图见图2。

2.1.3标准曲线与检出限先将反式肉豆蔻酸甲酯（C14:1n9t）、反式棕榈油酸甲酯（C16:1n9t）标准对照品用正己烷配成浓度分别为2 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1的系列标准溶液，然后在确定的气相色谱条件下进行检测。以标准溶液浓度作横坐标，相应峰面积作纵坐标绘制标准曲线进行线性回归，并根据S/N＝3确定检出限[12，13]，所得线性回归方程和相关系数以及检出限见表1。由此可见，确定的气相色谱分析条件下，方法具有较好的线性和较低的检出限。

图2　8种反式脂肪酸甲酯混合标品色谱图Fig.2　The chromatogram of the mixture of eight kinds of trans fatty acid methyl esters

表1　线性回归方程和检出限Table 1Linear regression equations and detection limit of GC

2.1.4回收率测定准确称取玉米油样品，加入反式肉豆蔻酸甲酯（C14:1n9t）标准对照品，每次检测重复3次取平均值，如此测定6组，计算对照品的回收率（结果如表2）。结果表明本气相色谱分析法的回收率在83.0%～91.2%之间，基本能满足实际测定需要。

表2　回收率实验Table 2The recovery experiment

2.2样品前处理条件的确定

2.2.1萃取剂的确定食用油中的反式脂肪酸主要成分是甘油三酯（TAG）。由于甘油三酯极性弱，因此必须采用合适的萃取剂将其变成游离脂肪酸再进行甲酯化衍生方可用GC分析[14-16]。萃取率的高低直接影响甲酯化反应产率，进而影响整个测定方法的准确性。因此选择合适的萃取剂显得尤为重要。常见的萃取剂有正己烷、二氯甲烷、苯、石油醚、氯仿、甲醇、环己烷等，酯化剂有氢氧化钠-甲醇、三氟化硼-甲醇、浓硫酸-甲醇、甲醇钠-甲醇等[17，18]。

本实验首先以玉米油甲酯化产物中反式油酸甲酯C18:1n9t为指标，比较了二氯甲烷、氯仿、石油醚、苯/石油醚、正己烷/二氯甲烷/甲醇（3/2/1，V/V/V）、氯仿/甲醇（2/1，V/V）分别作为萃取剂时对甲酯化反应产率的影响。结果发现石油醚、氯仿/甲醇（2/1，V/V）作为萃取剂时的酯化产率较高，但是氯仿相对毒性要高些，因此采用低毒性、低沸点的石油醚。

2.2.2酯化条件的确定酯化效果主要由酯化剂类型和浓度、酯化时间和温度等因素决定。酯化剂主要有酸性酯化剂和碱性酯化剂。酸性催化剂能使游离脂肪酸进行酯化，但是不一定能够发生酯交换。碱性酯化剂能够使酯化反应顺利向正向进行。通过参考国标中推荐使用的酯化剂[19]和本实验室之前的研究，设计了9组正交实验对酯化剂类型和浓度、酯化温度和时间进行了优化（见表3和表4），并设计了单因素浓度梯度实验（见表5）。

表3　正交设计影响因素及水平Table 3 Factors and levels of orthogonal design

表4　正交设计实验结果表L9（34）Table 4 Table of orthogonal design experimentresult L9（34）

表5　单因素优化实验结果Table 5Single factor experiment result

由表4可以看出，在一定范围内，酯化剂的类型和浓度对酯化效率影响最大，其次是酯化温度，再次是酯化时间。结合表5的单因素实验，发现采用两步酯化法，即先碱催化酯化后再酸催化酯化，酯化效果增加明显。通过分析、对照，最终确定最佳酯化条件是：于萃取剂处理后的样品中先加入2mL0.4mol·L-1氢氧化钾-甲醇，40℃下酯化反应30min，然后再加入2mL0.5mol·L-1硫酸-甲醇溶液，70℃二次酯化反应30min。

2.3食用油样品中反式脂肪酸的GC分析

以购买的经常食用的玉米油、人造奶油、黄油以及收集的油炸食品用后油品作为食用油样品，按照上述确定的前处理方法进行甲酯化后进行气相色谱分析，共处理5组平行样品，比较各样品中所含的反式脂肪酸的种类及含量（结果见表6）。

表6　油样中各反式脂肪酸含量分析Table 6 Content analysis of trans fatty acids in the samples

由表6数据可以看出，以所含脂肪为基准，常见食用油品中反式脂肪酸含量较多的是反式棕榈油酸和反式油酸，各种反式脂肪酸均能定量测定[20]。这为以后分析高温长时间油炸对反式脂肪酸的生成及影响分析打下了基础，为食品质量安全服务。

3　结论

确立优化了方便高效的对食用油反式脂肪酸甲酯化的前处理和气相色谱分离检测方法条件。

在极性DB-23（30 m×0.32 mm ID，0.25 μm）毛细管色谱柱上，配合适当的升温程序，即先在140℃时保持1 min，然后以10℃·min-1的升温速度升高至180℃，接着以2℃·min-1的升温速度升高至220℃，在220℃时保持20 min后再以5℃·min-1的升温速度升高至230℃，最后在230℃时保持16 min，食用油中常见的8种反式脂肪酸甲酯基本能够分离，方法的线性相关性、检出限和回收率基本能满足定性和定量分析的要求。确定了萃取剂的类型及用量后，将单因素试验和正交试验相结合，分析了两步酯化法中酯化剂类型和浓度、酯化温度和时间对酯化反应效率的影响，确定优化了两步酯化最佳条件，即先加入2 mL 0.4 mol·L-1氢氧化钠-甲醇，在40℃下先酯化30 min，然后再加入2 mL 0. 4 mol·L-1硫酸-甲醇在70℃下二次酯化50 min。应用所优化确定的检测食用油中反式脂肪酸时气相色谱和样品前处理条件对几种常见食用油品进行检测，可对含有的反式脂肪酸进行定性和定量分析。

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Study on the Gas Chromatography Analysis of Trans Fatty Acids in Edible Oils

SUN Hui-zhen，QU Sai-nan，QIU Li-qun*，SONG Shao-fang*
College of Chemistry and Material Science/Shandong Agricultural University, Taian 271018，China

Abstract:The analysis of trans fatty acids in edible oils was very important for their content control. Conditions of gas chromatography and sample preparation were optimized for analysis of trans fatty acids by gas chromatography. After treated by proper extractant and two-step methyl esterifying under the conditions determined by orthogonal design，trans fatty acids in edible oils were transformed successfully into corresponding trans fatty acid methyl esters. The conditions of two-step methyl esterification were as follows. The first step esterification was kept for 30 min under 40℃in 0.4 mol·L-1 sodium hydroxide-methanol and the second step esterification was kept for 50 min under 70℃in 0.5 mol·L-1 sulfuric acid-methanol. Those transformed trans fatty acid methyl esters could be separated and detected by three-step programmed temperature gas chromatography equipping polarity DB-23 capillary chromatographic column. Three-step temperature program was as follows. First，the column temperature was hold at 140℃for 1 min and then elevated to 180℃at the rate of 10℃·min-1 and subsequently to 220℃at the rate of 2℃·min-1. After maintained for 20 min at 220℃，the temperature was elevated to 230 ℃at the rate of 5℃·min-1 and was retained for 16 min at 230℃. This gas chromatography could analyze eight common trans fatty acids in edible oils and its linear correlation coefficient，detection limit and recovery rate all could meet the demands of qualitative and quantitative analysis.

Keywords:Edible oil；trans fatty acids（FTA）；gas chromatography；two-step methyl esterification

*通讯作者:Author for correspondence. E-mail:ssf@sdau.edu.cn

作者简介:孙慧珍（1991-），女，硕士研究生，主要从事色谱分离分析工作. E-mail:1534049288@qq.com

基金项目:山东省食品安全中心的省科技发展计划项目（2013GZX20109）

收稿日期:2015-08-01修回日期: 2015-09-22

中图法分类号：O657.7

文献标识码：A

文章编号：1000-2324（2016）01-0047-05