环介导等温扩增技术的改良及其在检测中的应用进展

蔡树东，吴 双，赵维芯，成大荣，朱善元，顾玲玲(.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 5009； .江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 500; .扬州大学 旅游与烹饪学院，江苏 扬州 5009)

环介导等温扩增技术的改良及其在检测中的应用进展

蔡树东1,2，吴 双2*，赵维芯3，成大荣1，朱善元2，顾玲玲1
(1.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009； 2.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300; 3.扬州大学 旅游与烹饪学院，江苏 扬州 225009)

环介导等温扩增(LAMP)技术是一种具有特异性强、灵敏度高、快速简便、扩增高效等优点的等温核酸扩增方法。近年来，该技术在许多方面得到了进一步的改进和发展，主要体现在多重LAMP技术的实现以及LAMP技术与其他技术的联合应用方面。对LAMP技术在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中的应用进展进行了综述，并对LAMP技术的应用前景进行了展望，为今后LAMP技术的发展及应用提供参考。

环介导等温扩增； 应用； 检测

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等[1]发现的一种恒温核酸扩增技术，与传统的PCR技术相比，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上。LAMP技术通过2对特异性引物对目的序列的6个区域退火杂交，利用BstDNA聚合酶的催化作用，在恒温条件下(60～65 ℃)温育30～60 min，实现对目标序列的批量扩增[2-5]。其反应结果可直接通过肉眼观察是否有白色焦磷酸镁沉淀产生进行判断，也可通过添加羟基萘酚蓝(HNB)、溴化乙淀(EB)、钙黄绿素或SYBR Green Ⅰ等荧光染料进行显色观察。

常规PCR和实时定量PCR技术是目前应用最广泛的分子生物学检测方法，但由于PCR方法操作繁琐，耗时长且对仪器设备要求较高，不适合临床快速检测。而LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、产物易检的优点且不需要昂贵的仪器和检测试剂，尤为适合基层和现场病原体检测。近年来，关于LAMP技术的研究已经取得了较大的进展，其方法也逐步得以改进，因此对LAMP技术方法的改进以及临床应用进行综述，并对其发展前景进行展望，旨在为LAMP技术的发展及应用提供参考。

1 LAMP技术的改良

LAMP技术自建立以来，已被广泛应用于细菌检测、病毒检测、转基因检测以及肿瘤检测和动物胚胎性别鉴定等方面。随着LAMP技术的不断改进与发展，逐渐向多重LAMP检测方向发展，也有研究者将LAMP技术与其他技术进行联合，开发了多种有效的检测方法。

1.1 多重LAMP技术

多重LAMP检测技术能在同一反应体系和同一反应条件下，实现对多个目标基因的快速检测。姜侃等[6]针对沙门菌的invA基因和金黄色葡萄球菌的nuc基因设计LAMP引物，建立了食品中沙门菌和金黄色葡萄球菌多重LAMP—熔解曲线检测方法。结果显示，该方法不但特异性好，而且对目标菌的检测灵敏度高(10 fg/μL)。袁向芬等[7]建立了猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的双重RT-LAMP检测方法，发现该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当，比常规RT-PCR高10倍。赵军等[8]针对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的nhe、nuc基因设计了2套LAMP引物，并建立了同时检测2种菌的二重LAMP检测方法，结果表明，该二重LAMP检测方法检测限达10 fg/μL。陈兵等[9]建立了禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)3种病毒的实时荧光多重反转录环介导等温扩增(multiplex real-time revese transcription-LAMP, mRT-LAMP)检测方法，结果表明，建立的mRT-LAMP检测方法可对AIV、NDV、IBDV同时进行筛选检测，灵敏度可达到10拷贝，与单重LAMP检测的灵敏度相当。王彩霞等[10]建立了同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法，并且采用酶切试验验证了双重LAMP检测方法的准确性。

1.2 LAMP技术与其他技术的联合应用

国内外学者将LAMP技术与其他技术进行联合，并研发了多种高效的检测方法。Marciniak等[11]将滚环扩增技术与LAMP技术相结合，成功实现对长为31 bp短片段核酸的快速检测。Fang等[12]在微孔道芯片的基础上，应用LAMP技术成功检测了假性狂犬病毒。Wang等[13]在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，成功将磁珠芯片与LAMP技术相结合。Seetang-Nun等[14]在检测白斑综合症病毒(WSSV)时，联合应用了纳米金颗粒标记的DNA探针和LAMP技术，2种技术的结合使得检测限低至200拷贝。Ravan等[15]将LAMP技术和酶联免疫吸附试验技术结合，建立了检测沙门菌血清组DNA的检测方法，结果表明，其检测限可达4 cfu/mL。翁琳等[16]将LAMP技术与基因芯片进行结合，对肺炎衣原体进行检测，结果表明，LAMP技术联合基因芯片技术具有高灵敏性和高特异性，可快速准确地检测肺炎衣原体。王瑞娜等[17]将环介导等温扩增技术与横向流动试纸条检测技术联合，建立了一种可用于单核细胞增生李斯特菌检测的方法。

2 LAMP技术的应用

LAMP技术已经被广泛应用于病原体检测、转基因食品检测、动物胚胎性别的鉴定及肿瘤的基因检测等领域[18-23]，具有很高的应用价值。

2.1 细菌检测

Nakamura等[24]建立了百日咳博德特氏菌的LAMP检测方法，为新生婴儿百日咳的快速诊断提供一种有效的手段。Song等[25]建立了布鲁氏菌的LAMP检测方法，并对4种布鲁氏菌和29株非布鲁氏菌进行检测，结果表明，该LAMP方法不仅特异性强，而且其最低检测限低至3.81 cfu/mL。李佳桐等[26]针对沙门菌STN基因设计了LAMP引物，并建立了检测沙门菌的LAMP检测方法，其检测限为10 cfu/mL，比常规PCR的灵敏度高10倍。刘哲等[27]以产气荚膜梭菌的α毒素全基因序列为保守序列设计LAMP引物，建立了产气荚膜梭菌LAMP检测方法，通过与常规PCR法灵敏性比较发现，LAMP法灵敏性是PCR法的1 000倍。刘亚娟等[28]根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)ApxIVA基因的保守序列设计引物建立了快速检测APP的LAMP检测方法，并用建立的LAMP方法和SN/T 1447—2011标准公布的方法对36份临床样品进行检测分析，结果表明，2种方法的符合率为100%。此外，一些研究者还应用LAMP方法成功检测到了炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、水中军团菌、迟钝爱德华菌、牙龈卟啉单胞菌、热带念珠菌、奔马赭霉暗色丝孢霉等病原微生物。

2.2 病毒检测

2.2.1 DNA病毒 张侃等[29]针对猪伪狂犬病病毒(PRV)gB基因设计引物，建立了PRV的LAMP检测方法，并与常规PCR方法进行比较，发现其与常规PCR方法检出率一致，但其最低检测限仅为10拷贝/μL，灵敏性是常规PCR方法的100倍。Yang等[30]成功建立了人乳头瘤病毒(HPV)和人类疱疹病毒2型(HSV-2)的LAMP检测方法，结果表明，2种方法具有相同的反应温度和时间，而LAMP检测HPV灵敏度为10拷贝/μL，检测HSV-2的灵敏度为100拷贝/μL。此外，研究者们还成功建立了HIV-1型病毒[31]、乙肝病毒[32]等DNA病毒的LAMP检测方法。

2.2.2 RNA病毒 Hosaka等[33]应用一步法RT-LAMP检测方法对HIV-1的pol(integrase)基因进行了检测，整个反应仅需要35 min即可完成，且灵敏度达到120拷贝/μL。Chen等[34]利用RT-LAMP法检测了猪繁殖与呼吸综合征病毒，发现 RT-LAMP检测技术较普通RT-PCR技术更快速更灵敏。钟璟皓等[35]建立了马尔堡病毒的LAMP可视化检测方法，并与常规PCR、实时荧光定量PCR进行对比，结果表明，LAMP法的灵敏度高于常规PCR和实时荧光定量PCR。罗思思等[36]针对H7和N9亚型AIV的HA、NA基因建立了RT-LAMP检测方法，并进行了特异性试验和灵敏性检测，结果表明，该方法具有良好的特异性，其灵敏度为10拷贝/μL。Geng等[37]建立了人类冠状病毒NL63的RT-LAMP检测方法，并对该方法的特异性和敏感性进行了评价，结果表明，该方法具有较高的特异性，其灵敏性为1 600拷贝/μL。此外，一些研究者也建立了甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒[38]等RNA病毒的RT-LAMP检测方法。

2.3 寄生虫检测

LAMP技术的开发为寄生虫病检测提供了较为准确便捷的方法。Kumagai等[39]针对28S核糖体分别设计了用于检测日本血吸虫的LAMP引物和常规PCR引物，并分别对感染了日本血吸虫的钉螺进行检测，发现2种方法具有相同的灵敏度，检测下限均为100 fg/μL。Niu等[40]和Kikuchi等[41]利用LAMP方法分别建立了大豆根结线虫和松材线虫的快速检测法，大大提高了检测效率。Adao等[42]对121名女性阴道拭子中阴道毛滴虫进行LAMP检测，结果表明，利用LAMP法的检出率为42.06%，而利用传统检测方法和常规PCR方法的检出率分别为8.26%和7.44%，而且LAMP方法灵敏度比常规PCR高出10倍。

2.4 真菌和支原体检测

邓显文等[43]建立了鸡滑液支原体(MS)的LAMP可视化检测方法，结果显示，该方法的敏感性可达到100拷贝/μL，是常规PCR方法的10倍。Suwancharoen等[44]对收集的533份牛尿样中钩端螺旋体进行LAMP检测和常规检测，发现LAMP检测法不仅具有较强的特异性，而且其准确性也高于常规检测方法。因此，LAMP在真菌和支原体检测中具有很好的应用前景。

2.5 动物胚胎性别鉴定

近年来，LAMP技术在动物胚胎性别鉴定方面也得到了应用，且准确率也很高。Khamlor等[45]利用LAMP技术检测牛胚胎性别，结果显示，在63 ℃下反应1 h便可实现扩增，且准确性高达100%。潘宏等[46]建立了LAMP法快速鉴定水牛早期胚胎性别体系，为预知水牛性别胚胎移植奠定了基础。该技术操作简单、准确率高、用时短，适合养殖场现场操作，为畜牧业发展带来巨大经济效益。

2.6 转基因检测

Chen等[47]利用LAMP方法检测7种转基因玉米品系，并成功用建立的方法对样品中的转基因玉米成分进行了检测。在国内，研究者们也建立了转基因玉米Bt176、MON89034和MON863的LAMP检测体系[48]，并成功实现对样品的检测。Zhou等[49]建立了转基因甘蔗中cry1Ac基因的LAMP检测方法，结果显示，该方法检测甘蔗基因组DNA的最低检测限为1.0 ng/μL。张明哲等[50]采用LAMP技术对转基因水稻Bt63进行检测，结果显示，LAMP技术检测转基因水稻Bt63特异性好，并且灵敏度达到0.01%。由于该技术不需要复杂仪器操作，其将会在检验检疫等一线工作中起到重要作用，成为转基因检测的一种有效手段。

2.7 肿瘤检测

Livingstone等[51]采用了LAMP技术对口咽部鳞癌中人乳头瘤病毒进行检测，结果显示，LAMP方法的灵敏性和特异性分别达常规PCR方法的99.4%和93.2%。Hao等[52]采用RT-LAMP法检测乳腺癌患者前哨淋巴结转移，并与食品和药物管理局批准的乳腺淋巴结试验(BLN)以及常规病理检查进行比较，结果显示，该RT-LAMP方法灵敏度高、特异性强，为临床检测提供了较好的方法。

3 小结与展望

LAMP是近年来新研发的一种核酸等温扩增技术，虽然其原理复杂，但操作十分简单，而且优势突出，该扩增技术所需设备简单廉价，扩增效率极高，耗时短。此外，LAMP具有特异性强、灵敏度高以及产物检测可视化等优点。尽管LAMP技术的优势已被研究领域广泛接受，但仍然需要对LAMP技术进一步改进与完善，例如，在引物的设计与筛选、产物的特异性检测和分离以及反应试剂的保存运输方面。通过科学技术不断地改进和发展，LAMP技术会在更多领域发挥更重要的应用价值。

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Progress on Improvement and Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification Method

CAI Shudong1,2,WU Shuang2*,ZHAO Weixin3,CHENG Darong1,ZHU Shanyuan2,GU Lingling1
(1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 2.Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College,Taizhou 225300,China; 3.College of Tourism and Cooking,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a kind of isothermal nucleic acid amplification method with high specificity,high sensitivity,fast and efficient amplification etc.Since its inception,the technology has been further improved and developed,mainly reflecting in multiplex LAMP and its combination with other technologies aspects.This paper primarily summarized its application in bacteria detection,virus detection,parasite detection,fungus and mycoplasma detection,sexing of animal embryos,genetically modified food detection and tumor gene detection in recent years,and looked into its application prospect,so as to provide reference for the development and application of LAMP technology.

loop-mediated isothermal amplification; application; detection

2015-12-12

江苏农牧科技职业学院科研项目(NSFPT201501); 江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目-校企合作基金项目 (201512806029H)

蔡树东 (1991-), 男, 甘肃武威人, 在读硕士研究生, 研究方向：预防兽医微生物学。 E-mail:1769507537@qq.com

*通讯作者：吴 双 (1983-), 女, 江苏徐州人, 副教授, 博士,主要从事动物传染病防控和流行病学研究。 E-mail:jswushuang@sina.cn

Q78

A

1004-3268(2016)08-0007-05