黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV及葫芦科作物抗性遗传改良研究进展

孙玉燕，牛晓伟，范 敏(浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021)



黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV及葫芦科作物抗性遗传改良研究进展

孙玉燕，牛晓伟，范 敏*
(浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021)

摘 要：黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是侵染葫芦科作物的重要病毒之一,对葫芦科作物的生产造成了严重威胁。本文对CGMMV的分布和分类,全基因组序列、进化关系及结构,CGMMV的检测方法,以及葫芦科CGMMV抗性的遗传分析及遗传改良包括抗性材料的筛选及种间杂交、基于基因工程的遗传改良、miRNAs测序及人工miRNAs等方面的研究进展进行综述。另外,对葫芦科作物CGMMV抗性遗传改良中存在的问题及应对策略进行了探讨和展望。

关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒;基因组;遗传分析;遗传改良

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160232

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)隶属于芜菁花叶病毒科烟草花叶病毒属［1］,具有较广泛的寄主范围,主要侵染黄瓜、西葫芦、葫芦、西瓜、甜瓜、南瓜、丝瓜、苦瓜和蛇瓜等葫芦科作物［2］,也可侵染苋色藜、曼陀罗、马齿苋、本氏烟和矮牵牛等作物［3］。CGMMV可引起叶片斑驳、系统花叶、褪绿、萎黄、褶皱,以及植株矮化、生长缓慢、结果延迟等症状,在成熟期可导致果实腐烂和纤维化,失去食用和商业价值［4-6］,给葫芦科作物生产造成严重威胁。

1　CGMMV的分布和分类

1.1分布范围

目前,CGMMV在全世界30多个国家和地区均有分布。最早于1935年由英国的Ainsworth报道在黄瓜上发生［7］,随后传入西班牙、德国、罗马尼亚、希腊和波兰等欧洲国家［8-12］; 20世纪60—70年代,因黄瓜、西瓜和瓠瓜引种而传入亚洲的日本、印度和伊朗［13-15］; 20世纪80—90年代传入韩国、我国台湾地区、前苏联、以色列和沙特阿拉伯［5,16-19］; 21世纪初,几乎所有的欧洲国家,以及中亚、东亚和南亚一些国家均有发生［11-12］。近年开始传入北美洲的加拿大和美国［20-22］。2002年,中国口岸检疫部门首次从日本引进的种苗中发现CGMMV。2004年,厦门出入境检验检疫局再次从日本进口的南瓜种子上检测到CGMMV［23］。随后在辽宁、北京、浙江、河北、甘肃、海南等地发生多起进口源性CGMMV,给农业生产造成巨大损失。为此,2006年12月21日,农业部发布了第788号公告,将CGMMV确定为全国农业植物检疫性有害生物之一。

1.2分类

根据报道地域和鉴别寄主苋色藜、曼陀罗等植物上的侵染症状,可将CGMMV分为6个株系［24］。

典型株系。即黄瓜绿斑驳花叶病毒。在英国和欧洲有报道［7］。果实上通常不引起症状,特定条件下在苋色藜上引起少量局部枯斑,不侵染曼陀罗和矮牵牛。

黄瓜桃叶珊瑚花叶株系。英国和欧洲有报道,印度也有类似株系的报道。在果实上可以引起显著的果实症状,在苋色藜上引起局部枯斑,而在曼陀罗上无症状。

西瓜株系。日本有报道［4］,在苋色藜上引起局部枯斑,而在曼陀罗上无该症状。

日本黄瓜株系。日本有报道［4］,在黄瓜上引起严重的果实畸形,在曼陀罗上引起局部枯斑,但苋色藜上无症状。

洋东株系。在洋东河日本的黄瓜上有记载,引起黄瓜果实畸形,在苋色藜、曼陀罗和矮牵牛上引起局部枯斑。

印度株系。在印度的葫芦科植物上有记载,引起泡斑、矮化和产量降低;在苋色藜上引起局部枯斑,在接种曼陀罗的叶片上不表现症状,不侵染烟草和矮牵牛。

2　CGMMV全基因组序列及结构

CGMMV为正单链线状RNA病毒,病毒粒体为杆状,大小为300×18 nm［25］。截止到2015年9 月17日,共有42个CGMMV分离物的全基因组序列提交到NCBI GenBank中,基因组大小约6.4 kb (6 325～6 425 bp) (表1),寄主包括西瓜、黄瓜、瓠瓜、南瓜、甜瓜、丝瓜和本氏烟草,分离物来源于日本、韩国、西班牙、俄罗斯、印度、以色列,以及中国台湾、海南、辽宁、山东、河南、浙江等多个国家和地区。利用MEGA 5.10软件对42个CGMMV的核苷酸序列进行系统进化分析发现,这42个分离物按照亲缘关系远近聚为2个基因型:亚洲类型和欧洲类型(图1)。其中来源于中国、韩国、日本、以色列、印度和加拿大的38个CGMMV分离物归到亚洲类型; SP,MC-1,MC-2 和VIROG-43M来源于西班牙和俄罗斯,属于欧洲类型。

CGMMV病毒含有5′端和3′端2个非编码区,5′端含有帽子结构,3′端有1个可接受组氨酸相似于tRNA状的结构［1］。帽子结构具有加强外壳蛋白翻译的稳定性,使其不易被降解［26］。CGMMV编码区包含4个开放阅读框,分别编码129 /186 ku,29 ku和17.3 ku蛋白［27］。其中,186 ku蛋白是由129 ku蛋白的开放读码框终止子通读产生的,186 ku和129 ku蛋白均与病毒复制有关,被称为RNA依赖性聚合酶蛋白［27］。29 ku蛋白为运动蛋白,协助病毒在细胞间移动［28］。17.3 ku蛋白为外壳蛋白,作为病毒粒子的重要的结构亚基,保护核酸并协同介导病毒的长距离运输［29］。

表1　GenBank中CGMMV全基因组序列信息

3　CGMMV的检测方法

CGMMV的检测技术有很多,包括生物学检测、电子显微镜技术、血清学检测、PCR检测和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)检测等。

图1　CGMMV核苷酸序列的系统进化分析

3.1生物学检测

生物学检测鉴定是植物病毒检测的传统技术,是其他检测方法的重要基础,为植物病毒病原诊断提供了一定的帮助。秦碧霞等［30］在同一温室中分离的病毒分离物不侵染苋色藜,但可在曼陀罗上产生局部褪绿斑,由此认为分离到CGMMV的另一个株系。黄静［31］取黄瓜病叶进行摩擦接种,其中黄瓜、南瓜、葫芦和西瓜症状表现为系统侵染,而苋色藜发病迟缓,出现红色斑点,曼陀罗上无症状,由此认为该病毒分离物可能属于日本西瓜株系。李海明等［32］将CGMMV分离物进行生物学鉴定,在葫芦科植物和苋色藜上均表现出发病症状,在黄瓜、南瓜、芋瓠、甜瓜上主要表现为系统花叶和有褪绿斑;而在苋色藜上表现为局部白色枯斑。接种结果初步表明,CGMMV-GX属于西瓜株系。虽然鉴别寄主或指示植物在植物病毒的生物学检测鉴定方面应用广泛,但存在时间长、易受环境和季节影响等限制,需要与其他检测方法结合才能得到较可靠的结果。

3.2电镜检测

电镜检测方法可直观显示病毒粒子的形态结构、病毒在寄主细胞内的存在状态、寄主细胞的结构变化等［33］。对沙特阿拉伯CGMMV的1个株系应用负染色方法进行鉴定,观察到侵染葫芦的CGMMV粒体形状为直杆状,大小为300～325 nm［19］。黄静［31］对接种CGMMV后的黄瓜病叶浸渍液经2%的磷钨酸负染后用透射电镜观察,观察到直杆状的病毒粒子,长度大约为300 nm,宽度大约为18 nm,与CGMMV病毒的典型粒子具有相同的形态。Shang等［34］对纯化后的CGMMV病毒颗粒进行电镜观测,发现典型的杆状病毒颗粒。Liu等［35］对接种CGMMV后的黄瓜叶片进行电镜检测,发现典型的大小为300×18 nm的杆状CGMMV病毒颗粒。利用光学相干断层成像术(optical coherence tomography,OCT),将感染CGMMV的黄瓜种子与健康种子进行鉴定,发现感病的种子种皮与胚乳之间存在窄间隙,而健康的种子中则不存在该间隙,进而将感病种子与健康种子区分［36］。由于电镜检测具有形态观察的直观性,对植物病毒的检测鉴定起到了较好的辅助鉴定作用。

3.3血清学检测

检测植物病毒的血清学方法较多,依据的原理都是基于构成不同病毒蛋白抗原决定簇的差异与相应抗体的特异性结合。目前,在CGMMV的检测上应用最多的是酶联免疫吸附法测定(ELISA)。使用改良的ELISA (M-ELISA)技术检测黄瓜种子是否带有CGMMV病毒,结果从800粒黄瓜种子中检测出1粒带毒种子［37］。利用ACP-ELISA和TASELISA技术对CGMMV病毒进行检测,其中ACPELISA可检测到0.16 ng的纯化病毒,而TASELISA可检测到至少0.04 ng的病毒［34］。血清学方法由于操作简单,结果准确,被广泛应用于各种病毒的检测,较适合田间大规模的鉴定。

3.4PCR检测

随着分子生物学的迅猛发展,尤其是PCR技术的成熟,为黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测提供了更为灵敏高效的技术方法,包括RT-PCR,real-time PCR和IC-RT-PCR。目前,应用较多的是RT-PCR技术。Liu等［35］利用CGMMV的CP蛋白基因序列设计引物,对接种后的黄瓜叶片、花和种子进行RT-PCR检测证明,CGMMV既可以通过受精的花朵进行水平传播,也可通过种子横向传播到下一代。另外,将PCR技术和荧光测定相结合的realtime PCR不仅可避免假阳性的出现,而且可提高检测的灵敏度,进行定量检测。Chen等［38］利用多引物系统并结合靶向CGMMV 3’非编码区的TaqMan探针,即real-time TaqMan RT-PCR技术,对在中国搜集到的CGMMV的分离物进行检测,可在黄瓜中检测到至少0.13 pg的CGMMV。免疫捕捉RT-PCR (IC-RT-PCR)是1种抗原检测系统,将1段已知序列DNA片段标记到抗原抗体复合物上,再用PCR方法将这段序列扩增,然后用常规PCR方法检测产物［10］。黄静［31］利用IC-RT-PCR技术,在接种后的黄瓜病叶、葫芦病叶、南瓜病叶和苋色藜枯斑均得到与预期大小相一致的目的条带。Shang等［34］利用IC-RT-PCR技术可检测到0.1 pg的病毒含量,灵敏度极高。PCR检测技术由于灵敏度高,结果可靠,已作为一种常规的检测方法,对CGMMV病情的控制和预防起到重要的作用。

3.5FISH检测

FISH的基本原理是将DNA (或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析［39］。FISH已应用于番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV)［40］、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)和马铃薯叶片卷曲病毒(Potato leafroll virus)的检测［41］。利用FISH技术在黄瓜和甜瓜的雄花中进行CGMMV的检测发现,花药组织被CGMMV感染,而花粉颗粒未被感染,该发现对于CGMMV的防治,特别通过种子的病毒传播具有重要的流行病学意义［42］。

4　葫芦科CGMMV抗性的遗传分析

目前,对CGMMV抗性的遗传分析研究还较少。通过对R×R,R×MR,R×S,MR×MR,MR×S和S×S等抗性不同的15个甜瓜组合配置六世代(P1,P2,F1,F2,BC1和BC2)进行遗传分析,发现CGMMV的抗性遗传主要由多基因控制并呈现隐性遗传特点,感病对抗病表现为不完全显性;在这15个组合中,有10个组合存在互作;除Phoot×Harela外,所有存在互作的组合表现为重复上位作用; Kachri×Phoot (R×R)在F1表现为杂种优势,F2表现为超亲分离［43］。CGMMV抗性的杂种优势为配置杂交组合提高抗病性提供了基础和依据。

5　葫芦科CGMMV抗性的遗传改良

5.1抗性材料筛选及种间杂交

通过对现有葫芦科栽培种和野生种进行接种鉴定,筛选具有抗(耐) CGMMV的种质资源。Rajamony等［44］鉴定到4份CGMMV抗性的甜瓜材料,其中,Phoot和Kachri为非沙漠类型,FM-1和FM-5为育种株系。对72份遗传背景差异较大的甜瓜材料采用人工摩擦接种的方法进行苗期CGMMV抗性鉴定,共鉴定到2份免疫材料(C.figarei和C.zeyheri)和8份高抗材料(PRM-6,FM1,Phoot,VRM-5-10A,VRM-5-10B,VRM-7-12A,VRM-31-1-2和VRM-29-1C)［45］。Mitsuhiro等［46］对主要来源于亚洲的20份甜瓜材料进行CMV-B2和CGMMV-K摩擦接种,并结合DAS-ELISA检测发现,其中4份材料抗CMV,未检测到抗CGMMV的材料。这些研究为葫芦科作物CGMMV抗原的寻找和筛选提供了参考。

由于野生材料具有栽培品种所不具备的重要特性,材料之间的远缘杂交对于品系的遗传改良至关重要。C.anguria和C.zeyheri均属于甜瓜亚属野生种,对CGMMV表现为抗性［47］。利用C.anguria 和C.zeyheri种间杂交,选育抗CGMMV的品种［48］。Skálová等［49］通过胚和种子挽救技术,获得C.anguria和C.zeyheri的种间杂交植株。种间杂交为CGMMV抗性材料的获得提供了基础。

5.2基于基因工程的遗传改良

转录后基因沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)或RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA (dsRNA)启动的序列特异的mRNA降解过程［50］。长链dsRNA被内切酶切成小的干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)［51］。这些siRNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而识别其互补的RNA并将其降解［52］。这种转录后基因沉默机制可被病毒诱导,形成siRNA介导的病毒防御机制［53-54］。因此,将编码病毒特异序列的dsRNA转入寄主中可以诱导病毒产生RNA沉默,进而提高寄主的抗性［55］。

植物病毒早期的转基因抗性植物多数是利用病毒的外壳蛋白。通过农杆菌介导法将病毒的外壳蛋白(CGMMV-CP)转入西瓜的砧木中,部分西瓜转基因植株对CGMMV表现为抗性［56］。将西瓜银色斑点病毒(watermelon silver mottle virus,WSMoV)的部分N端序列与黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)的部分CP基因序列融合成嵌合载体,通过农杆菌介导法转入西瓜,其中2个株系对CMV,CGMMV和WMV均表现为抗性［57］。此外,运动蛋白基因也被用于培育抗CGMMV病毒的转基因植物。将CGMMV运动蛋白基因的重复序列(DR-MP)在甜瓜中过表达,转基因植株对CGMMV表现出较高的抗性,并且转基因植物基因组DNA的胞嘧啶出现甲基化的现象［58］。除外壳蛋白和运动蛋白外,复制酶基因也被用于培育抗病毒植物。将含有缺陷CMV的复制酶基因的反向重复序列转化烟草,转基因植株产生有效的CMV抗性,并且在转基因植株接种病毒前后均有siRNAs的存在,表明抗性的产生是由RNA沉默导致的［59］。目前,还未见复制酶基因在葫芦科植物应用提高CGMMV抗性的相关报道。

5.3基于miRNAs测序和人工miRNAs的遗传改良

miRNAs测序技术可获得数以百万计的读数,使其成为揭示miRNAs表达模式、鉴定低表达量及特异miRNAs的有效途径。对接种CGMMV后10,30和50 d的黄瓜叶片进行小RNA测序,鉴定到可能与CGMMV的胁迫响应相关的8个novel miRNAs 和15个已知miRNAs。其中miRNA156通过调控其靶基因Csa6M091970.2和Csa6M091970.1参与微生物胁迫、信号转导和细胞发育等过程; miR390 在CGMMV侵染过程中表达的延迟黄瓜的开花时间,进而影响果实的发育;此外,miR171c,miR172d和miR2673也与CGMMV的胁迫响应有关［60］。这些小RNA及其靶基因为植株抗病性的改良提供了线索和基础。

人工miRNA (artifical microRNA)技术是利用内源miRNA前体骨架,通过替换miRNA序列产生具有新功能的miRNA［61］。除调控内源基因的表达外,人工miRNAs还可抵抗病毒的侵染。利用人工miRNA沉默芜菁黄化花叶病毒(TYMV)的沉默抑制蛋白P69和芜菁花叶病毒(TuMV)的沉默抑制蛋白HC-Pro,转基因拟南芥对芜菁黄化花叶病毒和芜菁花叶病毒具有高水平抗性［62］。烟草中表达针对黄瓜花叶病毒(CMV)的2b蛋白的人工miRNA表现出对CMV的抗性,其抗性水平超过siRNA介导的抗病毒水平［63］。张晓辉［64］通过设计识别CMV的2a/2b区和基因组的3’UTR的2个人工miRNAs并在番茄中过表达,转基因番茄植株表现出高水平的CMV抗性,通过嫁接和多重病毒复合侵染试验表明抗性是持续稳定的,且通过嫁接试验证明,人工miRNAs是一种细胞自主性的抗病毒分子。这为通过人工miRNA在葫芦科植物中进行抗CGMMV的研究提供了很有意义的参考。

6　问题和展望

目前,对于葫芦科作物CGMMV抗性的遗传改良虽然取得一定进展,但仍存在较多的问题,如可直接用于育种的抗源材料较少;对CGMMV抗性遗传规律的研究不深入;缺少CGMMV抗性基因的定位和用于辅助选育的分子标记;基因工程主要利用CGMMV病毒的衣壳蛋白和运动蛋白,而对于抗病机制仍不甚明确。针对这种现状,提出以下建议:加快对葫芦科作物CGMMV抗源材料的筛选,并利用远缘杂交技术将抗性基因转入到育种材料中;开展葫芦科作物抗CGMMV QTLs定位和分子标记开发,分子标记作为辅助选择手段,可以提高抗病品种的选择效率;进行葫芦科作物抗CGMMV的基因克隆,明确抗病的分子机制,并利用基因工程将抗性基因转移到农学性状优良的品种上。此外,还可利用组学如转录组、蛋白组学和miRNAs测序等技术和方法进行CGMMV的抗性改良。

除了利用传统育种及分子育种对葫芦科作物CGMMV抗性进行遗传改良之外,还需加强对CGMMV的预防和控制,如生产无病种子,加强种子检疫、种子除害处理,做好田间管理和药剂防治、土壤消毒及轮茬种植等策略,避免CGMMV的传播和扩散。

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(责任编辑：张瑞麟)

通信作者:范 敏,E-mail:fanminfm@sina.com。

作者简介:孙玉燕(1986—),女,山东菏泽人,助理研究员,博士,研究方向西甜瓜遗传育种,E-mail:syy1111@126.com。

基金项目:国家自然科学基金(31572145; 31272188; 31301787);浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903-2-10)

收稿日期:2015-12-16

中图分类号：S436.42

文献标志码：A

文章编号：0528-9017(2016)02-0240-08

文献著录格式:孙玉燕,牛晓伟,范敏.黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV及葫芦科作物抗性遗传改良研究进展［J］.浙江农业科学,2016,57 (2):240-247.