利用SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度

2016-03-31方小雪姚少林薄永明宁波微萌种业有限公司浙江宁波315012

浙江农业科学 2016年2期

方小雪，姚少林，薄永明(宁波微萌种业有限公司,浙江宁波 315012)

利用SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度

方小雪，姚少林，薄永明*
(宁波微萌种业有限公司,浙江宁波 315012)

摘要：以2个甜瓜杂交种东之星、含香雪及其亲本为材料,利用SSR标记对2组杂交种进行纯度鉴定。从供试的72对SSR引物中筛选到亲本间具有多态性的引物,东之星为3对,含香雪为3对,其中1对引物在2个杂交种的亲本间均存在多态性。对2个杂交种东之星和含香雪分别用筛选出的3个多态性的SSR引物进行甜瓜杂交种子纯度鉴定,鉴定结果分别为99.2%和97.2%。

关键词：甜瓜;纯度鉴定;分子标记; SSR标记

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160209

甜瓜(Cucumis melo L.)是一种色、香、味俱佳的水果,深受消费者喜爱,是我国重要的传统特色水果［1-2］。随着甜瓜杂交种的广泛推广和种业市场的日趋成熟,甜瓜杂交种纯度快速检验的重要性越来越突出。传统的杂交种纯度检测方法主要通过形态学鉴定,许多性状表现受栽培措施及环境的影响,鉴定者的观察经验也影响着鉴定的准确性。理想的鉴定技术不但要准确可靠,还要简单快速经济,这是品种鉴定实现商业化的前提,也是品种鉴定技术的发展趋势。

分子标记相对于传统的形态标记具有理论上标记数目无限、不受环境因素的影响等优点,使它的应用越来越广泛。本文以2个甜瓜杂交种东之星和含香雪的随机样本及其亲本为材料,利用SSR标记进行甜瓜F1代种子纯度鉴定,以期缩短纯度鉴定周期。

1　材料与方法

1.1材料

以2个甜瓜杂交种东之星、含香雪及其亲本为材料,由宁波微萌种业有限公司提供。

1.2方法

1.2.1播种与种植

东之星和含香雪及其亲本2015年2月10日穴盘播种,2015年3月25日定植田间进行田间纯度鉴定。

1.2.2DNA提取

取同批供试材料的种子催芽,待到种根长度达2 cm左右,将去除种皮和子叶的种根置于1.5 mL离心管中,CTAB法提取基因组DNA。

1.2.3PCR扩增与快速检测

72对甜瓜引物由嘉兴美之奥种业有限公司提供。PCR MasterMix由北京庄盟国际生物基因科技有限公司提供。所用PCR体系为20 μL,取DNA提取液2 μL (模板DNA浓度50 ng·μL-1),正反向引物各1 μL (引物浓度10 ng·μL-1),2×U Taq PCR MasterMix 10 μL,超纯水6 μL。PCR反应参数:95℃下预变性5 min后,95℃变性30 s,55℃退火30 s (退火温度依引物而异),72℃延伸45 s,共35个循环,最后72℃下延伸10 min。用3%琼脂糖凝胶检测。

2　结果与分析

2.1引物筛选

利用72对SSR引物对东之星和含香雪这2个杂交种的亲本DNA进行扩增,以筛选在亲本间具有多态性差异的引物。东之星引物筛选结果如图1,melo3,melo5和melo17这3个引物扩增的条带在亲本间有多态性,其他引物扩增的条带在亲本间无多态性差异。含香雪引物筛选结果如图2,melo5,melo38,melo48这3个引物扩增的条带在亲本间有多态性,其他引物扩增的条带在亲本间无多态性差异。

图1　3对引物对东之星的扩增结果

图2　3对引物对含香雪的扩增结果

在亲本间筛选出有多态性的5对引物如表1所示,在东之星和含香雪的亲本间分别筛选了3对具有多态性的引物,而且其中melo5引物在2个杂交种的亲本间均检测到多态性,说明melo5对引物可同时鉴定东之星和含香雪这2个杂交种的种子纯度。

表1　东之星和含香雪的亲本间筛选的5对SSR引物

2.2SSR分子标记纯度鉴定

SSR引物在F1代呈共显性,筛选出的在亲本间具有多态性的引物扩增出父母本互补的条带。从筛选的具有多态性的引物对每个杂交种进行种子纯度鉴定。SSR引物melo3对东之星部分种子扩增产物的电泳检测结果如图3所示,21粒真杂交种扩增出父母本互补的2条谱带,1粒假杂交种(箭头所示)扩增的谱带与母本一致,这可能由于授粉前母本去雄不彻底等原因,造成母本自交结实,使收获的杂交种混有少量母本的种子。melo5和melo17纯度鉴定结果分别如图4和图5,鉴定结果与melo3一致。随机选取同批东之星250粒,用以上3对引物进行纯度鉴定,248份材料扩增出父本和母本的条带,2份材料只扩增出母本条带,说明此248份杂交种为真杂种,2份材料为假杂种,东之星材料纯度为99.2%。

SSR引物melo38对含香雪部分种子扩增产物的电泳检测结果如图6所示,21粒真杂交种扩增出父母本互补的2条谱带,5粒假杂交种(箭头所示)扩增的谱带与母本一致,这可能由于授粉前母本去雄不彻底等原因,造成母本自交结实,使收获的杂交种混有少量母本的种子。melo5和melo48纯度鉴定结果分别如图7和图8,鉴定结果与melo3一致。选取同批次含香雪425粒,用以上3对引物进行纯度鉴定,413份材料扩增出父本和母本的条带,12份材料只扩增出母本条带,说明此样品中413份杂交种为真杂种,12份材料为假杂种,含香雪材料纯度为97.1%。

图3　melo3对东之星材料的扩增结果

图4　melo5对东之星材料的扩增结果

图5　melo17对东之星材料的扩增结果

图6　melo38对含香雪纯度鉴定结果

图7　melo5对含香雪纯度鉴定结果

图8　melo48对含香雪纯度鉴定结果

2.3田间纯度鉴定

东之星和含香雪分别田间定植300株,分别在苗期、结果期和成熟期进行田间纯度鉴定,东之星纯度鉴定结果为99.8%,含香雪纯度鉴定结果为98.4%。

3　讨论

3.1SSR标记鉴定与田间鉴定比较

本实验用SSR分子标记纯度鉴定结果为东之星种子纯度为99.2%,含香雪种子纯度为97.2%,田间纯度鉴定结果为东之星种子纯度为99.8%,含香雪种子纯度为98.4%。SSR分子标记纯度鉴定结果与田间纯度鉴定结果基本一致,但因SSR分子标记是从DNA分子水平进行标记,因此比田间肉眼观察更为严格,也更为准确。但实际生产当中,种子纯度鉴定标准并不需要做到分子水平那么严格,因此如何将田间鉴定结果与SSR分子标记结果统一,仍需要探索。

3.2SSR标记在品种鉴定中的应用

种子纯度是种子质量的重要指标,对作物产量及品质有直接影响［3］。目前,种子纯度鉴定的鉴定方法一般采取田间种植鉴定,不仅早期鉴定比较困难,还要耗费大量人力物力,很难满足生产中的需要。SSR标记在DNA水平上对作物进行标记,可以在苗期进行,不受环境的影响,稳定性和重演性好,易于分析,已在多种作物上用于鉴定种子纯度和品种真实性［4-8］。

本实验利用72对SSR引物对2个甜瓜杂交种的亲本DNA进行扩增,在东之星和含香雪的亲本间各筛选了3对具有多态性的引物,且引物melo5 在2个杂交种的亲本间均检测到多态性,说明这些有多态性差异的SSR引物可有效用于这2个甜瓜杂交种纯度的鉴定。本研究表明,SSR标记多态性高,较易筛选到合适引物进行种子纯度鉴定,简单快速,可以将SSR技术进行集成、规范和验证,应用到甜瓜种子质量的快速检测工作中去。

3.3多引物组合鉴定

在生产实际中,种子纯度不够的主要原因是田间去雄不彻底,产生自交种子。然而,对于飞入了其他父本的异源花粉的F1种子则需选取扩增条带位置各不相同的SSR引物,将它们组合起来扩增得到的特异分子标记,不仅可以区分混入F1中的亲本种子,而且可将混杂其中的其他品种的种子鉴别出来,以进一步提高检测的准确度［9］。本实验中,东之星和含香雪分别筛选了3对具有多态性差异的引物,且分别用3对引物对杂交种进行纯度鉴定,确保了鉴定结果的准确性。

参考文献:

［1］张红,喻梅辉,周志成,等.甜瓜分子标记纯度鉴定研究［J］.中国瓜菜,2006 (1):7-10.

［2］汤谧,别之龙,张保才,等.西瓜、甜瓜果实品质及调控研究进展［J］.长江蔬菜,2009 (2b):10-14.

［3］周志成,王惠林,王贤磊,等.SSR标记鉴定甜瓜品种“红月亮”种子纯度［J］.中国瓜菜,2014,27 (1):21-24.

［4］鲁忠富,徐沛,吴晓花,等.SSR分子标记技术在瓠瓜种子纯度快速鉴定中的应用［J］.浙江农业学报,2012,24 (4):578-581.

［5］李菊芬,许玲,马国斌.利用分子标记技术鉴定西瓜杂交种纯度［J］.上海农业学报,2009,25 (1):72-75.

［6］刘子记,牛玉,杨衍.热研一号油绿苦瓜种子纯度的SSR鉴定［J］.热带作物学报,2013,34 (11):2179-2182.

［7］张敏,谈太明,徐长城,等.SSR分子标记技术在茄子杂交种子纯度鉴定中的应用［J］.湖北农业科学,2013,52 (8):1959-1962.

［8］王全,张桂华,苗伟利.应用SSR技术进行黄瓜杂交种种子纯度鉴定［J］.长江蔬菜,2009 (7):43-44.

［9］柳剑丽,周寿春,宋晓华,等.利用SSR标记鉴定甜瓜杂交种的种子纯度［J］.分子植物育种,2006,4 (6):23-26.

(责任编辑：张韵)

通信作者:薄永明(1970—),男,浙江宁波人,高级农艺师,从事蔬菜良种选育及推广工作,E-mail:boyongming2@vip.sina.com。