假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液指标的影响

王定发 ，周璐丽 ，李　韦，周　雄 ，周汉林*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737；2.海南大学农学院，海南海口 570228)



假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液指标的影响

王定发1，周璐丽1，李韦2，周雄1，周汉林1*

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737；2.海南大学农学院，海南海口 570228)

摘要:本试验旨在研究假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液指标的影响。270只1日龄海南文昌公鸡，随机分为6个组，每组3个重复，每重复15只，T1、T2和T3组为对照组(依次分为不感染不给药组、感染不给药组、感染给药组)；T4、T5和T6组为假蒟添加组，分别在基础日粮中添加200、400、600 mg/kg假蒟提取物粉剂。15日龄时，每组随机抽取30只鸡，除T1组灌服生理盐水外，其他各组鸡均经口接种柔嫩艾美耳球虫卵囊悬液，分别于接种前1 d，接种后3、6、9 d清晨采血测定其血液指标。结果表明，与感染球虫不给药的T2组相比，假蒟组(T4、T5、T6)可以显著降低感染球虫鸡粪便中球虫卵囊值(P<0.05)。假蒟组在感染球虫后第6天，与T1组比，RBC、HGB、HCT、 Ca2+、Na+、Cl-、TP、 ALB、GLB、TG、CHOL、 T4等指标呈下降趋势；但在感染球虫后第9天，TP、 GLB含量均显著高于T1组(P<0.05)；在感染球虫后第6天，假蒟组与对照组相比，ALT、AST浓度水平均显著降低(P<0.05)。结果提示，假蒟提取物能提高感染球虫后鸡机体免疫机能，降低肝脏损伤，降低鸡感染球虫后粪便卵囊值，具有一定的抗球虫效果。

关键词:鸡球虫病 ；假蒟提取物；柔嫩艾美耳球虫；血液指标

鸡球虫病(Coccidiosis in chicken)是一种发病率广、致死率较高的危害性极强的常见寄生虫病，它主要寄生于鸡机体肠道部位，可导致病愈后雏鸡生长受阻，降低成年母鸡产蛋能力，严重影响鸡体增重。球虫属中，柔嫩艾美耳球虫致病力最强、分布最广，它可侵入鸡盲肠上皮细胞，引起盲肠高度肿胀，肠壁增厚，肠内充血，同时还可显著影响鸡血液生理生化指标[1-2]。目前，主要应用疫苗防治[3]和化学药物防治，但化学药物易产生耐药性，可引起药物残留、影响肉食品安全等。植物类提取物具有不易产生耐药性、毒副作用小、促进机体生长、提高机体免疫力等优点[4-5]，开发应用植物类提取物在畜禽养殖中替代或减少化学药物用量是今后畜禽健康养殖中的趋势。

假蒟(PipesarmentosumRoxb.)为胡椒科属(Piperaceae)植物，在我国海南省分布广泛，喜生于山谷密林、橡胶林中或村旁潮湿阴凉处。已有研究表明，假蒟具有解热镇痛、抗炎、抗氧化的作用[6]，且其对蚜虫、斜纹夜蛾、椰心叶甲等多种植物害虫均表现出较好的广谱杀虫活性[7-8]，Qin W Q等[9]研究表明，假蒟杀椰心叶甲虫的机理可能是由于其能抑制虫体AchE、CarE、GSTs和Na+、K+-ATP酶活性，从而发挥拒食素和直接毒性作用。目前，关于假蒟对动物类寄生虫的影响研究鲜有报道。本文旨在研究假蒟提取物对感染球虫鸡粪便卵囊值、血液生理生化指标的影响，为其作为保健型饲料添加剂在畜禽寄生虫类疾病防控中的应用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1假蒟提取物粉剂将新鲜采集的假蒟地上茎叶部分(采自中国热带农业科学院橡胶所橡胶林)65 ℃烘干(水分控制在10%左右)，粉粹，采用超临界CO2提取法得到膏状假蒟提取物，然后将其与二氧化硅粉按1∶1比例均匀混合即为假蒟提取物粉剂。

1.1.2抗球虫药抗球虫药地克珠利溶液购自某兽药公司，每100 mL地克珠利溶液兑水200 kg，连续饮用5 d，在本试验中用于作为药物对照。

1.1.3球虫卵囊柔嫩艾美耳球虫卵囊，由中国农业大学动物医学院提供。试验用卵囊由试验前经人工感染无球虫雏鸡继代1次获得，29 ℃孢子化后，4 ℃保存待用。

1.1.4试验用动物270只1日龄海南文昌公鸡，购于海南省儋州市种鸡场。

1.1.5雏鸡饲料 T1、T2和T3组为对照组，分别为不感染球虫不给药组、感染球虫不给药组和感染球虫给药组，饲喂肉鸡基础日粮。T4、T5和T6组为感染球虫组，分别在基础日粮中添加200、400、600 mg/kg假蒟提取物粉剂。

1.2方法

1.2.1试验设计及分组将试验场地、鸡栏在试验前统一消毒处理，270只1日龄健康海南文昌公鸡采用单因素完全随机设计，随机分为T1、T2、T3、T4、T5和T6 6个处理组，每处理组3个重复，每重复15只鸡，分栏饲养，自由采食。15日龄时，除不感染不给药的T1组外，其余各组每只鸡接种柔嫩艾美耳球虫卵囊悬液(含卵囊1×105个)，分笼饲养，自由采食。整个试验期间，T1、T2和T3饲喂未添加任何抗球虫药物的基础日粮；只用假蒟组T4、T5和T6分别饲喂在基础日粮中添加200、400、600 mg/kg假蒟提取物粉剂的饲料。T3组于感染球虫后第3天，在饮水中加入地克珠利溶液，连续饮用5 d。

1.2.2样品采集及指标测定在感染球虫后第4天至第8天，收集每组鸡粪便，按照Me Master's法计算每克粪便球虫卵囊数(OPG值)。于感染前1d清晨对T1、T2和T3组试验鸡中共随机选取5只鸡，对T4、T5和T6组试验鸡随机各选取5只鸡采血；于感染后第3天对T1、T4、T5和T6组试验鸡随机各选取5只鸡，对T2和T3组试验鸡随机共选取5只鸡采血；于感染后第6、9天对各组试验鸡随机各选取5只鸡采血。从颈静脉采血5 mL，取1.5 mL全血加入EDTA-K2抗凝管中，采用全自动血球分析仪测定红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、红细胞压积(HCT)及血红蛋白浓度(HGB)、血小板数(PLT)。剩余血液加入离心管中，分离血清，采用试剂盒法(南京建成生物工程研究所)测定。测定指标及方法：血清钾(K+)、氯(Cl-)、钙( Ca2+)采用微板法；钠(Na+)、镁(Mg2+)采用比色法；血清总蛋白(TP)采用双缩脲终点法；白蛋白(ALB)采用溴甲酚绿比色法；球蛋白(GLB)采用双缩脲法；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)采用分光光度法；总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)采用酶剂法；三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)采用放免法；尿酸(UA)采用比色法。

1.2.3数据处理对试验数据采用SAS 9.0统计软件ANOVA程序进行方差分析，并用Tukey's法进行多重比较，P<0.05表示差异显著性水平。

2结果

2.1假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡粪便球虫卵囊值的影响

各组鸡在感染球虫后第4天到第8天粪便球虫卵囊值见表1。 由表1可以看出，阴性对照组鸡粪便中未观察到球虫卵囊。在感染球虫后第4天至第8天，假蒟组(T4组、T5组、T6组)粪便OPG值均显著低于T2组(P<0.05)，而显著高于药物对照组(T3组)。在感染后第6天，粪便OPG值达到最高，第7天后开始逐渐降低。

表1　各组鸡粪便OPG值

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05), and with same letters mean no significant difference(P>0.05).

2.2假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液生理指标的影响

由表2可知，鸡感染球虫前第1天和鸡感染球虫后第3天，各组之间WBC、RBC、HGB、HCT差异均不显著(P>0.05)。鸡感染球虫后第6天，T3组与T5组、T6组之间RBC、HGB差异显著(P<0.05)，T3组HCT显著高于T2组、假蒟组(T4组、T5组、T6组)(P<0.05)。在鸡感染球虫后第9天，各组之间WBC 、RBC、HGB、 HCT差异均不显著(P>0.05)。

表2　鸡血液WBC、RBC、 HGB、 HCT 和PLT指标

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同或不标表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05), and with same letters or without letter mean no significant difference(P>0.05).

2.3假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血清生化指标的影响

2.3.1对鸡血清K+、Ca2+、Mg2+、Na+和Cl-浓度的影响由表3可知，鸡感染球虫后第6天，T1组与T5组、T6组之间血清Ca2+浓度有显著差异(P<0.05)，T1组、T3组与T2组、假蒟组(T4组、T5组、T6组)之间血清Na+浓度有显著差异(P<0.05)，T1组、T3组与T6组之间血清Cl-浓度有显著差异(P<0.05)，而到第9天，各组之间血清离子浓度均无显著差异(P>0.05)。

2.3.2对鸡血清TP、ALB、GLB、AST、ALT的影响由表4可知，鸡感染球虫前1天，T6组的TP水平显著高于T4和T5组(P<0.05)，T6组的GLB水平显著高于其他各组(P<0.05)；鸡感染球虫后第6天，T1组的TP、ALB水平显著高于其他组(P<0.05)，T5和T6组的TP水平与T3组之间差异显著(P<0.05)，假蒟组(T4组、T5组、T6组)的ALB水平与T3组之间差异显著(P<0.05)。T1组的GLB、ALT水平显著高于T5和T6组(P<0.05)，T1组的AST水平显著高于假蒟组(T4组、T5组、T6组)(P<0.05)；鸡感染球虫后第9天，T1组的TP水平显著低于T5和T6组(P<0.05)，T3组ALB水平与T2组和T4差异显著(P<0.05)，T1组的GLB水平显著低于T4、T5和T6组(P<0.05)，T6组ALT水平显著低于T1组和T3组(P<0.05)。

2.3.3对感鸡血清TG、CHOL、UA、T3、T4的影响由表5可知，鸡感染球虫后第6天，T1组的TG、CHOL水平显著高于假蒟组(T4组、T5组、T6组)(P<0.05)，T1组的T4水平显著高于其余各组(P<0.05)；鸡感染球虫后第9天，T3组的UA水平均显著高于其他各组(P<0.05)，T1组的T3水平显著高于T2和T5组(P<0.05)。

3讨论

3.1假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡粪便球虫卵囊值的影响

本试验中，鸡感染柔嫩艾美耳球虫后第6天，粪便中球虫卵囊数达到最高，这与球虫的生长发育周期有关，球虫卵囊侵入鸡肠道上皮细胞，进行裂体生殖和配子生殖，然后形成卵囊随粪便排出体外。柔嫩艾美耳球虫主要寄生于鸡盲肠上皮细胞，破坏肠道黏膜组织。目前对鸡球虫病的防治主要依靠化学药物，如地克珠利、妥曲珠利等，这些化学药物可以显著降低感染球虫鸡盲肠病变和粪便球虫卵囊[10]。在本试验中，感染球虫后在饮水中添加地克珠利溶液，显著降低了粪便中球虫卵囊数。

表3　鸡血液K+ 、Ca2+、Mg2+、 Na+和Cl-指标

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同或不标表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05), and with same letters or without letter mean no significant difference(P>0.05).

表4　鸡血液TP、ALB、GLB、AST和ALT指标

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同或不标表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05), and with same letters or without letter mean no significant difference(P>0.05).

表5　鸡血液TG 、CHOL、UA、T3和T4

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著(P<0.05)，所标字母相同或不标表示差异不显著(P>0.05)。

Note: Values with different letters in the same column mean significant difference(P<0.05), and with same letters or without letter mean no significant difference(P>0.05).

有研究表明，假蒟提取物含有生物碱、黄酮和总酚类等活性物质[11-12]。本试验中，假蒟组和感染球虫不给药组相比，显著降低了感染球虫鸡粪便球虫卵囊数，可能是因为假蒟提取物可以直接杀灭球虫卵囊或阻止卵囊在肠黏膜增殖，从而减少了粪便中的球虫卵囊数量。

3.2假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液生理指标的影响

本试验中，T2、假蒟组(T4组、T5组、T6组)在感染球虫的第5天到第6天，RBC数、HGB含量、HCT均出现不同程度的下降，但与T1组相比，差异不显著。可能是因为雏鸡感染球虫第5天到6天后，球虫裂殖体在肠上皮细胞内生殖进入高峰期，引起盲肠急性出血，短时间内血量急速减少，造成大量红细胞的丧失，机体一时补充不足引起贫血所致[13]。

3.3假蒟提取物对感染柔嫩艾美耳球虫鸡血液生化指标的影响

3.3.1对鸡血清离子浓度的影响在鸡感染球虫后第6天，假蒟组与T1组相比， Ca2+浓度均出现下降的趋势，可能是因为鸡感染球虫后引起盲肠出血， Ca2+作为凝血因子之一，参与启动机体的凝血途径，防止大量出血，T5和T6组 Ca2+浓度与T1组有显著差异，可能因为T5和T6组能更加积极地调动 Ca2+参与机体的凝血过程。T2、假蒟组(T4组、T5组、T6组)与T1和T3组相比，Na+、Cl-浓度均降低，有研究表明，柔嫩艾美耳球虫感染能引起机体Na+、Cl-浓度的降低[13]，与本试验结果一致，可能是因为鸡感染球虫后，影响了采食量，机体食盐摄入减少，同时机体肠道因球虫侵入受到一定的损伤，影响其吸收功能，使机体代谢功能发生紊乱所致。

3.3.2对鸡血清TP、ALB、GLB、AST、ALT的影响本试验中，在鸡感染球虫后第6天，与T1组相比，各组总蛋白、白蛋白和球蛋白均呈现下降的趋势，可能是因为柔嫩艾美耳球虫是一种寄生于小鸡盲肠上皮细胞内的原虫，它可导致盲肠上皮细胞的破坏、脱落，盲肠壁增厚、发炎，甚至出血，不但夺取机体不少蛋白质等营养物质，而且影响机体对蛋白质的吸收，使总蛋白含量降低。但到鸡感染球虫后第9天，添加假蒟提取物组与T1组相比，总蛋白、球蛋白均显著升高，说明假蒟提取物能积极调动机体的免疫功能[6]，促进伤口愈合和机体恢复功能。

谷丙转氨酶(ALT)主要分布于肝细胞胞浆内，谷草转氨酶(AST)分布于肝细胞浆及线粒体内,测定血清中此2种酶含量可反映肝组织功能状态是否正常，用以协助诊断疾病和观察愈后。当肝细胞受损、肝细胞膜通透性增加时，均可引起血清中ALT 、AST 浓度显著升高。在鸡感染球虫后第6天，3个对照组之间ALT、AST浓度均无显著差异，但添加假蒟提取物的试验组与对照组相比，ALT、AST浓度水平均显著降低，且在鸡感染球虫后第9天，T6组与T1组相比ALT浓度显著降低，说明假蒟提取物具有较强的护肝功能，且随着饲料中假蒟提取物添加量呈剂量效应，它能保护肝细胞，抑制ALT、AST的升高，并能稳定肝细胞膜，抑制ALT、AST释放入血，有效防治肝损伤。

3.3.3对鸡血清TG、CHOL、UA、PRL、T3、T4的影响血清总脂最主要包括甘油三酯和总胆固醇，甘油三酯是体内能量的主要来源总，总胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分。已有研究表明[14-15]，鸡感染球虫后4 d～7 d，总脂含量明显降低，与本试验结果一致，这可能是与此时段感染球虫鸡食欲下降，采食量降低，养分吸收障碍导致脂类吸收减少有关。

尿酸水平的增加与肾脏疾病正相关，尤其是肾小管的损害。本试验中，在鸡感染球虫后第9天，T3组尿酸水平均显著高于其他各组，说明地克珠利对鸡肾脏有一定程度的功能损害副作用。

T3、T4是甲状腺分泌的主要甲状腺激素，是诊断甲状腺功能的主要指标。主要作用为促进新陈代谢，维持机体正常发育。本试验中，鸡感染球虫后第6天，T3水平各组之间差异不显著，而各组T4水平与T1组相比，较显著降低，可反映出此时段鸡受到球虫感染后，营养摄入不足，吸收不良等因素影响了机体内分泌系统，可能出于机体自身的保护机制，甲状腺功能相对减低，降低了机体基础代谢率。

假蒟提取物能积极调动感染柔嫩艾美耳球虫后鸡机体免疫机能，并具有较强的护肝作用，同时，能降低鸡感染球虫后粪便卵囊值，具有一定的抗球虫效果。

参考文献:

[1]郭全海，赵耀光. 接种不同数量柔嫩艾美耳球虫卵囊对雏鸡的致病作用[J].动物医学进展，2015，36(7)：74-77.

[2]史东辉，李爱花，马学会，等. 植物提取物对肉仔鸡生产和屠宰性能、血清IgG和粪便球虫卵囊数量的影响[J].中国畜牧杂志，2013，49(6)：61-64.

[3]曹利利，姚新华，郭衍冰，等.柔嫩艾美耳球虫SAG2基因的克隆及其在卡介苗中表达[J].动物医学进展，2015，36(9)：1-5.

[4]Dkhil M A. Anti-coccidial, anthelmintic and antioxidant activities of pomegranate (Punicagranatum) peel extract[J]. Parasitol Res, 2013, 112: 2639-2646.

[5]Shanmugasundara R, Sifri M, Selvaraj R K. Effect of yeast cell product (CitriStim) supplementation on broiler performance and intestinal immune cell parameters during an experimental coccidial infection[J].Poult Sci,2013,92:358-363.

[6]Damsud T， Adisakwattana S. Three new phenylpropanoyl amides from the leaves ofPipersarmentosumand their a-glucosidase inhibitory activities[J]. Phytochem Lett, 2013, 6(3): 350-354.

[7]刘红芳，邸仕忠，符悦冠. 假蒟不同极性部位提取物对斜纹夜蛾卵的生物活性[J]. 南方农业学报，2014，45(6)：995-999.

[8]冯岗，袁恩林，张静，等. 假蒟中胡椒碱的分离鉴定及杀虫活性研究[J]. 热带作物学报，2013，34(11)：2246-2250.

[9]Qin W Q, Huang S C, Li C X, et al. Biological activity of the essential oil from the leaves ofPipersarmentosumRoxb. (Piperaceae) and its chemical constituents onBrontispalongissima(Gestro) (Coleoptera: Hispidae) [J]. Pestic Biochem Phys, 2010, 96: 132-139.

[10]袁保京，黎先伟，金立志，等. 几种抗生素替代性饲料添加剂对感染球虫肉鸡的抗炎作用[J]. 中国畜牧杂志，2014,50(6)：51-56.

[11]Fernandez L, Daruliza K, Sudhakaran S, et al. Antimicrobial activity of the crude extract ofPipersarmentosumagainst methicilin-resistantStaphylococcusaureus(MR-SA),Escherichiacoli,VibriocholeraandStreptococcuspneumoniae[J]. Eur Rev Med Pharmaco, 2012, 16:105-111.

[12]Hssain K, Ismail Z, Sadikun A, et al. Antioxidant, anti-TB activities, phenolic and amide contents of standardized extracts ofPipersarmentosumRoxb. [J]. Nat Prod Res 2009,23(3):238-249.

[13]周作勇，聂奎，郑静君. 中药 "球康"对雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫部分血液理化指标的影响[J]. 安徽农业科学，2011，39(8)：4714-4715.

[14] 李佩国，李蕴玉，张香斋，等. 雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后血清生化指标的动态变化[J].中国兽医学报，2008，28(6)：676-679.

[15]韦进钟，吴玄光，林辉环. 鸡感染柔嫩艾美耳球虫后某些血清生化指标变化的研究[J]. 中国兽医杂志，2003，39(3)：8-11.

Effects ofPipersarmentosumExtract on Blood Indexes of Chickens Infected withEimeriatenella

WANG Ding-fa1, ZHOU Lu-li1, LI Wei2, ZHOU Xiong1, ZHOU Han-lin1

(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou,Hainan, 571737,China;2.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou,Hainan, 570228,China.)

Abstract:The present research was designed to study the effects of Piper sarmentosum extract on blood parameters of chickens with coccidian infection. Two hundred and seventy 1-day-old Wenchang roosters were randomly divided into six groups of 45 birds each. T1, T2 and T3 were control groups, and they were non-coccidian infection with no administration group, coccidian infection with no administration group and coccidian infection with administration group, respectively. The birds of T4, T5, and T6 groups were fed with the basal diet plus Piper sarmentosum extract powder at 200, 400, 600 mg/kg. At 15-day-old age, 30 chickens in each group (except T1) were randomly selected and were fed with Eimeria sporozoite by oral, respectively. Thirty chickens in T1 group were fed with normal saline. Blood samples were collected and determined at one day before sporozoite feeding, three, six, and nine days after sporozoite feeding, respectively. The results showed that Piper sarmentosum extract could reduce coccidia oocysts in feces of chickens infected with coccidia(P<0.05). RBC, HGB, HCT, Ca2+, Na+, Cl-, TP, ALB, GLB, TG, CHOL and T4 in the blood of birds in T4, T5 and T6 groups at 6 days after infection had the trend to decrease. However, the concentration of TP and GLB in the T4, T5 and T6 groups at 9 days after infection increased significantly as compared to T1 group (P<0.05 ). The concentration of ALT and AST in the T4, T5 and T6 groups at 6 days after infection decreased significantly as compared to T1, T2 and T3 groups, respectively (P<0.05). In conclusion, Piper sarmentosum extract can improve immune function, reduce liver damage and reduce coccidian oocysts in feces of chickens after infection.

Key words:Coccidiosis; Piper sarmentosum extract; Eimeria tenella; blood parameter

文章编号:1007-5038(2016)02-0057-07

中图分类号:S853.75;S852.723

文献标识码:A

作者简介：王定发(1979-)，男，湖北随州人，助理研究员，博士，主要从事饲料资源开发利用研究。 *通讯作者

基金项目：海南省重大科技项目课题(ZDZX2013008-4)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(1630032015042，16300320150046)

收稿日期：2015-06-16