猪瘟病毒四种不同抗原卵黄抗体中和效力评价

江馗语

(辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁沈阳 110161)

猪瘟病毒四种不同抗原卵黄抗体中和效力评价

江馗语

(辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁沈阳 110161)

本研究通过基因工程技术，在大肠杆菌中高效表达了含猪瘟病毒E2基因中抗原指数较高且含有中和性抗原域的A1/A2区以及B、C区中抗原性较高、命名为tE2的重组蛋白和猪瘟病毒重复中和表位4P1重组蛋白、4P2重组蛋白，将上述3种重组蛋白和猪瘟活疫苗与白油佐剂混合乳化作为免疫原分别免疫产蛋鸡制备抗猪瘟病毒卵黄抗体，并对抗体效价和对猪瘟病毒的中和作用进行了检测和初步研究。

猪瘟病毒；E2基因；表位串联；卵黄抗体；生物学功能

近年来，随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段表达重组蛋白作为免疫原制备卵黄抗体的方法也逐渐受到广泛关注并取得了良好效果[1]。本研究以猪瘟病毒重复中和表位4P1重组蛋白、4P2重组蛋白，含有猪瘟病毒中和抗原区的tE2重组蛋白和猪瘟活疫苗与白油佐剂混合乳化作为免疫原分别免疫产蛋鸡制备了均可不同程度中和猪瘟病毒的抗猪瘟病毒卵黄抗体，为猪瘟的紧急预防提供了物质基础，并进一步证明了所选中和表位能够诱导机体产生中和抗体，在表位疫苗研究及有中和效力的卵黄抗体的制备上具有潜在的应用价值。

1 方法

1.1 免疫原的制备

1.1.1 猪瘟病毒重复中和表位的串联及表达 根据文献[2，3]选择分别位于E2基因693～716和828～842氨基酸残基位置的两个猪瘟病毒B细胞线性中和表位（分别命名为P1、P2），对 P1：CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT；P2：，QTAVSPTTLRTEVVK的编码核苷酸序列进行优化后，所有序列合成时均连接到去除所有多克隆位点的克隆载体pUC57上。利用表位串联技术获得P1-6×His片段和P2-6×His片段。之后将串联4次的表位基因片段4P1/4P2连接于表达载体pET-32a，转化Rosetta感受态细胞进行诱导表达。经SDS-PAGE分析后用Western blot对表达产物进行鉴定。

1.1.2 猪瘟病毒tE2基因的克隆及表达 以猪瘟活疫苗（细胞源）的总RNA为模板，RT-PCR扩增包含具有中和性抗原域的A1/ A2区以及B、C区一段抗原性较高的，位于E2基因754～880氨基酸残基位置的区域，并克隆于表达载体pCold I，转化Rosetta感受态细胞进行诱导表达。经SDS-PAGE分析后用Western blot对表达产物进行鉴定。

1.2 卵黄抗体的制备

以上述3种重组蛋白和猪瘟活疫苗与白油佐剂混合乳化分别作为免疫原免疫产蛋鸡。将乳化好的免疫原采用胸肌分点注射的方法对9月龄产蛋母鸡进行免疫，每隔两周加强免疫一次，共免疫三次，免疫剂量：猪瘟活疫苗，一免免疫剂量10头份，二免10头份，三免10头份；tE2纯化蛋白，一免免疫0.5mg，二免1.0mg，三免1.5mg；4P1纯化蛋白，一免免疫0.4mg，二免0.6mg，三免0.8mg；4P2纯化蛋白，一免免疫0.4mg，二免0.6mg，三免0.8mg。上述四种免疫原均免疫4只鸡。二免后1周开始收集鸡蛋，收至三免后4周。收集的鸡蛋采用氯仿提取法提取卵黄抗体。

1.3 卵黄抗体效价检测

用优化后的最佳抗原包被量和二抗最佳工作浓度，采用间接ELISA方法测定各组卵黄抗体针对其包被抗原的效价。

1.4 卵黄抗体效力评价

1.4.1 体外细胞免疫荧光中和试验 将四种卵黄抗体浓缩3倍后和猪瘟阳性血清用双抗处理，检验无菌后，56℃，30min灭活，分别用足量与25μl猪瘟活疫苗（兔脾淋源）繁殖出的猪瘟病毒中和，之后进行5倍稀释，防止卵黄抗体不能完全中和猪瘟病毒，接入细胞后，病毒会大量迅速繁殖，免疫荧光观察时出现大量荧光，不能判定抗体是否有中和作用。稀释后的卵黄抗体和阳性血清与猪瘟病毒的中和液接入PK-15细胞，同时设置阳性接毒对照。37℃、5%CO2条件下培养，24h及48h后取出，加入抗猪瘟弱毒苗卵黄抗体作为一抗（1：50稀释），FITC标记的兔抗鸡IgG作为二抗（1：100稀释），荧光显微镜下观察。

1.4.2 兔体中和试验 8只健康的家兔平均分成4组，根据体外细胞免疫荧光中和试验结果，将中和猪瘟病毒效果较好的两种卵黄抗体（抗猪瘟活疫苗卵黄抗体、抗4P1重组蛋白卵黄抗体）浓缩7倍，之后无菌处理，检验无菌后取1ml浓缩后的抗体与经灭菌生理盐水稀释含20RID的猪瘟兔化弱毒（原液每ml含3×105个RID）1ml等体积混合。摇匀后，置10～15℃中和1～2h（中间振摇2～3次）。中和完毕，分别注射每组2只家兔，每只耳缘静脉注射1ml，即每只家兔攻入10RID。同时设立病毒对照组和抗体对照组。每隔6h测一次体温，每天4次，连续一周观察体温情况，按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准（2001）》－猪瘟活疫苗（I）中的规定判定结果。

2 结果

2.1 免疫原鉴定

2.1.1 串联重组蛋白的表达鉴定 经SDS-PAGE及Western blot分析，表达的串联重组蛋白4P1和4P2蛋白大小约33Ku和29Ku，均与预期大小一致。

1、3、6、7.蛋白质分子量标准;2.纯化后的4P1重组蛋白4.纯化后的4P2重组蛋白;5.4P1纯化蛋白Western blot分析8.4P2纯化蛋白Western blot分析

2.1.2 tE2重组蛋白的表达鉴定 经SDS-PAGE及Western blot分析，表达的tE2重组蛋白大小约18Ku，均与预期大小一致。

1、3.蛋白质分子量标准;2.纯化后的tE2重组蛋白4.tE2纯化蛋白Western blot分析

2.2 制备的卵黄抗体效价检测

以猪瘟活疫苗和tE2重组蛋白作为免疫原获得的卵黄抗体用tE2重组蛋白作为包被抗原，ELISA效价最高值分别为1：1024和1：4096；以4P1重组蛋白作为免疫原获得的卵黄抗体用4P1重组蛋白作为包被抗原，ELISA效价最高值为1：4096；以4P2重组蛋白作为免疫原获得的卵黄抗体用4P2重组蛋白作为包被抗原，ELISA效价最高值为1：1024。

2.3 卵黄抗体效力评价

2.3.1 体外细胞免疫荧光中和试验 正常细胞对照无荧光，阳性接毒对照，24h和48h免疫荧光检查均有多数荧光出现，猪瘟阳性血清、抗猪瘟活疫苗卵黄抗体、抗4P1重组蛋白卵黄抗体与猪瘟病毒中和后进行5倍稀释接入PK-15细胞，24h和48h免疫荧光检查均无荧光出现。抗tE2重组蛋白卵黄抗体与猪瘟病毒中和后进行5倍稀释接入PK-15细胞，24h和48h免疫荧光检查有荧光出现，但比阳性接毒对照的荧光数少，抗4P2重组蛋白卵黄抗体与猪瘟病毒中和后进行5倍稀释接入PK-15细胞，24h和48h免疫荧光检查有荧光出现，但也比阳性接毒对照的荧光数少。说明抗猪瘟活疫苗卵黄抗体、抗tE2重组蛋白卵黄抗体、抗4P1重组蛋白卵黄抗体、4P2重组蛋白卵黄抗体均可不同程度中和猪瘟病毒，抗猪瘟活疫苗卵黄抗体和抗4P1重组蛋白卵黄抗体中和效果相对较好。

2.3.2 兔体中和试验结果 攻毒对照组的两只家兔呈现典型的定型热反应（++）：两只兔体温均从攻毒后第48h开始上升，体温最高分别可达41.5℃和41.7℃，第84h左右恢复正常体温，期间有3次体温升高超过1℃以上，呈现典型的稽留热。猪瘟活疫苗卵黄抗体效力评价组的两只家兔均出现轻热反应（+）：两只兔体温均从攻毒后第54h开始上升，体温最高分别可达40.6℃和40.8℃，比攻毒对照组家兔的最高体温低1℃左右，第78h左右体温恢复正常，体温升高比较迟缓且曲线较平滑，这表明猪瘟活疫苗卵黄抗体能够延缓和降低兔体发热，具有一定的保护作用。4P1串联蛋白卵黄抗体效力评价组的一只家兔体温正常（－），一只出现轻热反应（+）：出现轻热反应的兔体温从攻毒后第54h开始上升，体温最高可达40.8℃，比攻毒对照组家兔的最高体温低1℃左右，第72h左右体温恢复正常，体温升高比较迟缓且曲线较平滑，这表明4P1串联蛋白卵黄抗体也能够延缓和降低兔体发热，且有一只兔体温正常，表明该抗体也具有一定的保护作用。抗体对照组两只家兔体温无反应（－）：家兔体温正常。

3 讨论

卵黄抗体具有较高的免疫活性，注射后可直接提高机体抗体水平，与相应的抗原发生快速免疫反应，作用迅速、疗效确切，可用于一些动物传染病的紧急预防治疗。同时，卵黄抗体具有产量高、成本低、稳定性高、适合产业化生产等优势，并且在免疫、提取、纯化等方面均已取得了良好进展[4]，从而证明了卵黄抗体对猪瘟紧急预防的可行性和有效性。而目前研究制备的抗猪瘟病毒卵黄抗体均以猪瘟兔化弱毒疫苗作为免疫原，但不同厂家的疫苗质量不一，导致免疫剂量难以确定，同时疫苗的制备工艺繁琐，自己繁毒工作量大，使用过程中会存在散毒的危险，不利于卵黄抗体的标准化生产。卵黄抗体的制备利用重组蛋白作为抗原，抗原的制备具有稳定、无感染性、生产周期短、易制备、易纯化并且易于定量等优点，避免了猪瘟兔化弱毒疫苗作为免疫原的不足。

对本研究结果进行分析，猪瘟活疫苗包含的猪瘟兔化弱毒全病毒具有病毒基因中所有中和性抗原区或表位，抗原也具有天然构象。以其为抗原制备的卵黄抗体完全针对靶病毒，其对病毒的中和效果也相对较好。tE2基因中虽然包含中和表位且抗原性较高，但可能针对猪瘟病毒具有中和作用的抗原表位数量不够，因此以tE2重组蛋白作为免疫原制备的卵黄抗体对病毒的中和能力相对较弱。重复中和表位4P1和4P2重组蛋白是将E2基因上的两个中和表位重复串联4次，在大肠杆菌中表达获得的。将中和表位串联后表达的串联重组蛋白利用定位精确、氨基酸序列较短的抗原表位，既能够有效地被免疫系统识别、递呈，又能诱发机体产生特异性细胞或体液免疫应答，与弱毒活疫苗和抗原区蛋白相比，它减少了疫苗和抗原区蛋白中与刺激产生中和抗体无关的成分，其免疫所产生的抗体全部直接针对靶抗原，特异性强，更加安全可靠。因此抗4P1重组蛋白卵黄抗体对猪瘟病毒的中和作用相对较好。抗4P2重组蛋白卵黄抗体对猪瘟病毒的中和作用相对抗4P1重组蛋白卵黄抗体和抗猪瘟活疫苗卵黄抗体稍弱，可能是由于中和表位P2与全病毒的结合能力不如中和表位P1，这在蛋白纯化后的Western bolt鉴定结果中可以看出。

本研究用四种不同抗原制备的抗猪瘟病毒卵黄抗体为猪瘟的紧急预防提供了候选生物制剂，可以用于生产实际。

[1] 刘文鑫大肠杆菌F4、F5天然菌毛及表达蛋白鸡卵黄抗体的制备及初步应用[D].东北农业大学，2010．

[2] 冯瑜菲.猪水肿病大肠杆菌毒力因子鸡卵黄抗体制备及Stx2e基因LAMP方法建立[D].东北农业大学，2011．

[3] 田宏，吴锦燕，李双辉，等．猪瘟重组E2蛋白的兔体免疫保护研究[J].华北农学报，2009，（24）：225-228．