花生AhFAD2-1基因与油酸/亚油酸比值的关系

迟晓元，郝翠翠，陈明娜，潘丽娟，陈 娜，王 通， 王 冕，杨 珍，梁成伟*，禹山林*

( 1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2.青岛科技大学生物系，山东 青岛 266042)



花生AhFAD2-1基因与油酸/亚油酸比值的关系

迟晓元1，郝翠翠2，陈明娜1，潘丽娟1，陈 娜1，王 通1， 王 冕1，杨 珍1，梁成伟2*，禹山林1*

( 1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2.青岛科技大学生物系，山东 青岛 266042)

花生AhFAD2-1由位于不同基因组上的两个非等位基因AhFAD2-1A和AhFAD2-1B共同编码，这两个基因的突变引起酶结构、酶活性或表达调控的变化，共同导致高油酸性状的产生。本研究通过对13个不同花生品种(系)的AhFAD2-1基因进行测序和比对分析，查找点突变或插入位点，寻找与高油酸性状关联的基因位点。结果表明：E11、花育30、鲁花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2，其相应的O/L值为1.01～1.40；鲁花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2，其中E12S较特殊O/L值为9.05，其他品种O/L值为1.54～1.97；E16、E18和花育32号的基因型是ol1ol1ol2ol2，其相应O/L值为12.3～41.85。本研究结果对于高油酸性状的分子鉴定以及高油酸花生新品种的培育具有一定的参考价值。

花生；AhFAD2-1；油酸/亚油酸比值(O/L)；基因突变

花生是我国重要的油料和经济作物之一，籽粒含油量约占种子干重的44.27%～53.86%[1-2]。而其储藏油脂中80%左右为不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸仅占20%左右[2]。不饱和脂肪酸主要包括油酸和亚油酸。研究发现，富含高油酸的花生油对人体健康有益，长期食用高油酸的油类食品能够降低心脑血管疾病的发生率，并且能够很好地预防肥胖[3]。花生种子O/L(油酸/亚油酸)比值与花生的品质和贮存时间有直接关系，高油酸花生能够长时间储藏而不变质，并且能够保持较好的口感和品质；亚油酸因其含有不饱和键而不稳定，亚油酸含量高的花生油易氧化、腐败，这严重影响了花生油的品质和货架时间[4- 5]。因此，选育高油酸花生品种已成为研究的热点之一。

Δ12脂肪酸去饱和酶(AhFAD2)催化油酸在碳12位上脱氢生成亚油酸，AhFAD2酶活性丧失是产生高O/L比值花生的主要原因之一[6-8]。目前从花生中已经分离出多个FAD2基因，包括4个内质网定位的FAD2基因和2个叶绿体定位的FAD2基因[9-10]。前期研究表明，AhFAD2-1是控制籽粒油酸、亚油酸含量和O/L比值的关键酶。栽培种花生是异源四倍体(2n=4x=40，AABB)，AhFAD2-1由位于不同基因组上的两个非等位基因AhFAD2-1A和AhFAD2-1B共同编码，这两个基因的突变引起酶结构、酶活性或表达调控的变化，共同导致高油酸性状的产生[6-7]。Moore和Knauft(1989)将F435与普通花生杂交后，普通花生和高油酸花生F2代的分离比是3∶1或15∶1，因此可以推测高油酸花生受两对隐性基因ol1和ol2控制[11]。禹山林以F435作高油酸亲本与12个美国大花生品种配制杂交组合，并以大花生为轮回亲本回交3次，结果表明，花生高油酸(80%左右)性状由2对隐性基因(ol1ol1ol2ol2)控制[12]。Jung等(2000)研究验证了高油酸性状的ol1位点和ol2位点分别编码花生的AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因的可能性[6-7]。

目前发现的花生品种自然变异或诱变高油酸突变体中AhFAD2-1A基因突变位点都相同，而AhFAD2-1B基因突变位点不同[8]。对于AhFAD2-1A基因，序列的第448 bp位置由碱基A取代原来的碱基G，使天冬酰胺替代天冬氨酸(D150N)。高油酸天然突变体F435的AhFAD2-1B基因在起始密码子后441与442位置中有一个碱基A插入，导致移码突变，使翻译提前终止[6-7]。高油酸突变体M2-225和C458分别是在AhFAD2-1B基因起始密码子后997bp和665bp处存在MITE插入，导致基因功能丧失[13]。Wang等[14]利用叠氮化钠处理花育22号，获得了油酸含量显著提高的突变体。AhFAD2-1B基因编码区第281位由C突变为T，导致所编码的氨基酸序列在第94位由异亮氨酸变为苏氨酸。Fang等[15]用EMS处理鲁丰2号，也获得了油酸含量显著提高的突变体。EMS突变体AhFAD2-1B基因编码区第313位C突变成T，导致所编码的第105位组氨酸突变成酪氨酸。酵母表达证实，该突变型AhFAD2-1B基因功能已丧失。

本研究通过对不同花生品种(系)的AhFAD2-1基因进行测序和比对分析，查找点突变或插入位点，寻找与高油酸性状关联的基因位点，为花生高油酸育种提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验于山东省花生研究所莱西花生种植试验基地进行。13个花生品种(系)分别为E18、E16、花育32、E12S、花育19、花育17、花育23、鲁花14、花育30、鲁花12、E11、豫花15和河北高油，于5月初播种，9月中旬收获。

1.2 DNA提取及PCR扩增

利用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit (Ver.3.0)提取13个花生品种(系)的叶片基因组DNA。采用基因特异的引物FAD2-1A-F/FAD2-R和FAD2-1B-F/FAD2-R来分别扩增AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因。FAD2-1A为5'-GATTACTGATTATTGACTT-3'，FAD2-1B为5'- CAGAACCATTAGCTTTG -3'，FAD2-R为5'-CTCTGACTATGCATCAG-3'。

1.3 PCR产物的克隆和测序

将扩增获得的PCR产物进行纯化回收，连接至pMD18-T载体，转化TOP10感受态后筛选阳性克隆送往测序公司进行序列测定，即得到了基因的序列。

1.4 脂肪酸甲酯的制备

将待测的花生种子研磨成粉末，准确称取10～15mg花生种子粉末倒入大EP管，加入体积比为1∶1的苯、石油醚1～2mL静置5～10min。向大EP管中继续加入2mL浓度为0.5mol/L的甲醇钠试剂，室温放置10min；加入事先配制好的饱和氯化钠溶液2mL，离心或放置20min以上至出现上清，吸取上层液体60μL加入上样瓶，并用600～700μL石油醚稀释后进行气相色谱检测。

1.5 气相色谱分析

使用Agllent Technologies 6890N气相色谱仪，色谱柱为FFAP，检测器为氢火焰离子化检测器，分流比20∶1。进样口温度250℃，柱温150～230℃程序升温，升温速率为20℃/min，检测器温度250℃，自动打火5min后可进样。尾吹气为高纯氮气，流量40mL/min，氢气流量45mL/min，空气流量450mL/min，进样量1μL。

1.6 数据分析

采用面积归一法计算各种脂肪酸的相对含量(%)。脂肪酸相对含量计算公式：

相对含量(%)=Ai/∑Ai×100

每个样品3个重复，其中Ai为第i种脂肪酸组分的峰面积，∑Ai为各种脂肪酸组分的总面积。依次进行计算并记录，利用Microsoft Office Excel 2010作图分析。

2 结果与分析

2.1AhFAD2-1基因SNP检测和序列比较

利用FAD2-1A-F/FAD2-R特异性PCR引物扩增AhFAD2-1A基因片段，预期扩增片段大小1228 bp。利用 FAD2-1B-F/FAD2-R特异性PCR引物扩增AhFAD2-1B基因片段，预期扩增片段大小1220 bp。通过琼脂糖凝胶电泳，选择目标片段切胶纯化，然后通过克隆测序对13个材料的AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因片段进行了序列比对和分析，发现了2个SNP位点。 第一个SNP是AhFAD2-1A基因起始密码子后448 bp的G/A替换(GAC/AAC)，导致编码蛋白的氨基酸从天门冬氨酸替换为天门冬酰胺(D/N)。第二个SNP是AhFAD2-1B基因起始密码子后441bp与442bp之间有一个碱基A插入，导致移码突变，使翻译提前终止。

2.2 花生脂肪酸组分的测定结果

所测13个品种(系)油酸含量占总脂肪酸含量的38.2%～83.7%，油酸含量为E18>E16>花育32>E12S>花育19>花育23>鲁花14>花育17>花育30>豫花15>E11>鲁花12>河北高油。亚油酸含量占总脂肪酸含量的2.0%～37.8%，亚油酸含量由高到低的排列次序大致与油酸含量相反。鲁花14、花育23、花育17、花育19、E12S、花育32、E16、E18这些品种籽粒的O/L值均大于1.5，在1.57～41.85之间。其余品种的O/L比值均小于1.5，在1.01～1.4之间。

2.3AhFAD2-1基因与籽粒O/L比值之间的关系

花生高油酸的产生受ol1和ol2两个隐性非等位同源基因的共同调控。具有活性的AhFAD2-1A和AhFAD2-1B分别是由OL1和OL2编码的。ol1是AhFAD2-1A的一个隐性突变等位基因，能导致其编码的酶功能降低或丧失活性；ol2是AhFAD2-1B的隐性突变等位基因，它的改变导致AhFAD2-1B不能编码正常有活性的蛋白。花生高油酸的基因型是ol1ol1ol2ol2；而普通油酸的显性纯合基因型是OL1OL1OL2OL2[16]。

结合各个品种AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因突变的情况(附表)可以确定，E11、花育30、鲁花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2，因为在这几个花生品种中AhFAD2-1A和AhFAD2-1B皆不存在基因突变；鲁花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2，因为在这些品种中，AhFAD2-1A突变成为它的等位基因ol1，而AhFAD2-1B没有发生基因突变；E16、E18和花育32号的基因型是ol1ol1ol2ol2，因为在这2品种中AhFAD2-1A和AhFAD2-1B都发生基因突变。研究发现，AhFAD2-1A基因存在G448A点突变和AhFAD2-1B基因存在442A点插入的花生品种籽粒的O/L比值提高较大，高达41.85；AhFAD2-1A基因存在G448A点突变的花生品种籽粒的O/L比值相对提高。但品系E12S只有AhFAD2-1A基因存在突变，O/L比值却较高(9.05)，是否有其他基因表达不同导致了O/L值的差异，还需进一步的研究。

3 讨 论

花生高油酸性状由两对隐性基因ol1和ol2共同调控，种子高油酸(油酸含量高于70%)性状的产生是由AhFAD2-1A和AhFAD2-1B基因共同突变导致的[17-21]。雷永等(2010)研究发现，花生ahFAD2A突变型基因ahFAD2A-m主要分布在密枝亚种(普通型和龙生型变种)材料中，而野生型基因ahFAD2A-wt主要分布在疏枝亚种(珍珠豆型和多粒型变种)材料中。核心种质中密枝亚种材料种子的油酸含量显著高于疏枝亚种，与其普遍携带突变型基因ahFAD2A-m密切相关[20]。周丽侠等(2011)研究表明在13个花生品种中，AhFAD2基因皆存在AhFAD2A、AhFAD2B和假基因三类转录本，它们的表达调控方式及编码蛋白的活性决定了花生籽粒油酸含量和O/L比值。AhFAD2A基因的若干位置存在多态性，其中在448位由G-A的点突变与花生籽粒的O/L比值提高相关联；与AhFAD2A基因相比，AhFAD2B基因相对保守，且其活性对O/L比值的影响更大[2]。黄冰艳等(2012)也发现AhFAD2A基因G-A突变与种子油酸含量和油亚比高度正相关[22]。王允等(2015)研究发现AhFAD2基因型与O/L值的高低有着直接的关联，但与花生含油量之间的相关性不显著，也表明等位基因单一突变效果不如双突变对不同花生基因型的O/L值影响大[23]，这与本实验研究结果相符。

本研究通过对不同花生品种(系)的AhFAD2-1基因进行了测序和比对分析，确定了花生不同品种(系)的基因型。发现，E11、花育30、鲁花12、豫花15、河北高油的基因型是OL1OL1OL2OL2，其相应的O/L值为1.01～1.40；鲁花14、花育17、花育19、花育23、E12S的基因型是ol1ol1OL2OL2，其中E12S较特殊，O/L值为9.05，其他品种O/L值为1.54～1.97；E16、E18和花育32号的基因型是ol1ol1ol2ol2，其相应O/L值为12.3～41.85。本实验中品系E12S只存在AhFAD2-1A基因突变，但是O/L比值却较高(9.05)，是否有其他基因表达不同导致了O/L值的差异，还需进一步的研究。本研究为开展高油酸杂交育种提供了理论指导和技术支持。

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Correlation betweenAhFAD2-1 and Oleic Acid/Linoleic Acid Ratio in Different Peanut Varieties

CHI Xiao-yuan1,HAO Cui-cui2,CHEN Ming-na1,PAN Li-juan1,CHEN Na1, WANG Tong1,WANG Mian1,YANG Zhen1,LIANG Cheng-wei2*,YU Shan-lin1*

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China;2.BiologyDepartment,QingdaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266042,China)

A high oleic/linoleic acid ratio (O/L) in peanut (ArachishypogaeaL.) seeds is controlled primarily by two non-allelic genes,AhFAD2-1AandAhFAD2-1B(ol1andol2).13 peanut varieties (lines) were selected to detect the genotype ofAhFAD2-1A/AhFAD2-1Bgene to improve the peanut-breeding efficiency.The results showed that the genotypes of E11,Huayu30,Luhua12,Yuhua15 and Hebeigaoyou areOL1OL1OL2OL2,and the corresponding O/L value is between 1.01～1.40.The genotypes of Luhua14,Huayu17,Huayu19,Huayu23 and E12S are ol1ol1OL2OL2,and the corresponding O/L value is between 1.54～1.97,except for E12S (9.05).E16,E18 and Huayu32 are ol1ol1ol2ol2,and the corresponding O/L value is between 12.3～41.85.This study provides the fundamental information for molecular identification and new variety breeding of high oleic acid peanut.

peanut;AhFAD2-1; oleic/linoleic acid (O/L) ratio; gene mutation

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.04.004

2016-09-05

2014年国家“万人计划”青年拔尖人才；国家花生产业技术体系项目(CARS-14)；山东省自然科学基金项目(ZR2014YL011； ZR2014YL012)；国家自然科学基金项目(31000728)；山东省农业科学院青年科研基金项目(2016YQN14)；山东省农业科学院青年英才培养计划

迟晓元(1979-)，女，山东龙口人，山东省花生研究所副研究员，博士，主要从事花生油脂和脂肪酸代谢研究。

*通讯作者：梁成伟(1979-)，副教授，从事植物生物技术、分子生物学及生物信息学研究。E-mail:liangchw117@126.com

S565.2; Q754

A

禹山林(1956-)，研究员，主要从事花生遗传育种研究。E-mail:yshanlin1956@163.com