转录组学技术及其在瓜菜作物上的应用

张艳艳，季苇芹，杨玉文，关 巍，赵廷昌

（1.吉林农业大学农学院 长春 130118； 2.植物病虫害生物学国家重点实验室·中国农业科学院植物保护研究所 北京 100093）

随着功能基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术[1]。利用转录组学技术分析植物对生物胁迫和非生物胁迫的应答机制，成为当前逆境生理研究中的重要课题[2]。Velcuescu等[3]首先提出了转录组的概念，它是生物体的特定细胞或组织在某一功能状态下转录出所有RNA的集合，包括mRNA和各种非编码RNA，如rRNA、tRNA、还有最近发现的snoRNA、snRNA、microRNA等。对组织或细胞中的RNA反转录为cDNA并利用近几年兴起的转录组测序技术（RNA-squencing，RNA-seq）进行测序，可以发现未知转录本、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）以及各种分子标记等基因资源，能够反映出物种转录本的结构和表达水平，并可以揭示逆境胁迫下植物的分子机制，其应用具有远大前景。目前对于瓜菜作物的遗传学背景了解甚少，其基因组信息还比较缺乏，对一些关键基因以及对生物和非生物胁迫应答的机制也不是很清楚。转录组学作为功能基因组学的前沿学科，在弄清楚植物与环境互作的信息方面发挥着不可替代的作用，被越来越多地应用到瓜菜作物的研究中来，为获得瓜菜作物与环境互作的关键基因及重要代谢通路等生物学信息奠定理论基础，同时对克隆瓜菜作物重要功能基因、遗传多样性分析、种质资源鉴定以及分子标记辅助育种均有不可估量的作用。笔者对功能基因组学中的转录组学的主要技术方法及在瓜菜作物上的应用予以阐述。

1 转录组学的主要技术方法

随着研究的深入，人们建立了一系列的方法和技术用于转录组学的研究，目前研究转录组学主要有表达序列标签（Expressed squence tags，ESTs）、基因表达系列分析技术（Serial analysis of gene expression，SAGE）、大规模平行测序技术（Massively parallel signature sequencing，MPSS）、基 因芯 片（Microassay）及基于二代测序技术的转录组测序分析（RNA sequencing，RNA-seq）等方法。其中，由于RNA-seq能够较为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息，故成为最新兴起的利用深度测序进行转录组分析的技术，受到广泛关注。

1.1 表达序列标签（Expressed sequence tags，ESTs）

表达序列标签是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单向测序获得长度300～500 bp的cDNA部分序列，携带有表达基因的部分遗传信息[4]。通过将ESTs数据库与基因数据库已知序列进行比对，可以了解到生物生长发育、繁殖分化、遗传变异和衰老死亡等一系列生命过程。ESTs已广泛应用于基因识别、基因图谱的绘制、基因预测、基因克隆及功能分析等多个方面。在瓜菜作物如黄瓜、甜瓜、番茄、辣椒和西瓜等基因表达研究[5]、构建遗传学图谱[6]及分子遗传标记[7-13]研究中也有相关报道。

1.2 基因表达系列分析技术（SAGE）和大规模平行测序技术（MPSS）

基于短序列测序的转录组研究方法，SAGE是Velculescu等[14]在1995年首次建立的一种高效、快速分析基因表达谱的开放性差异基因表达技术。该技术无需知道物种的基因组信息，便能够整体地检测所有转录本的表达水平，对发现低拷贝基因有着重要意义[15]。然而多数序列标签为低丰度转录本，并不适合对遗传信息匮乏的瓜菜作物转录组研究。

MPSS技术是在SAGE技术上进行改进，由Brenner等[16]2000年建立，成为一种新型基因克隆技术，可以获得更长的短标签序列，从而提高转录本的精确度。其特有的微球荧光测序还可以直接高通量读出序列[17-18]，被认为是功能基因组研究的有效工具，可在短时间内检测到细胞或组织内几乎所有基因的转录情况。

然而，这2种技术过程中包含了酶切、克隆或杂交等繁琐步骤，这些步骤可能会导致序列出现碱基偏向性，从而影响转录本的正确性[19]。

1.3 基因芯片（Microassay）技术

基因芯片是基于核酸杂交的一种转录组研究技术，利用红、绿荧光染料分别标记实验样本和对照样本cDNA，混合后与基因芯片杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度[20]。目前，基因芯片主要应用于基因表达检测、寻找新基因、基因突变及基因文库作图等方面研究。

基因芯片技术比较成熟，能够准确地检测较高表达的基因。但因杂交背景高，受基因拷贝数的限制无法检测出低丰度基因，以及数据库数据有限，可能出现注释错误。

1.4 转录组测序技术（RNA-sequencing，RNA-seq）

以双脱氧终止法核酸技术（Sanger技术）为代表的第一代测序技术完成了人类基因组的绘制，在测序长度（可达 1 000 bp）和碱基准确率（高达99.999%）有着明显的优势，但因其实验周期长，花费大和测序通量低，并不能满足在大规模测序中应用的需求[21-23]。

随着生命科学的发展进入后基因组时代，应运而生的是RNA-Seq技术，它可同时对数十万乃至数百万条DNA进行测序，也可用于检测总RNA或mRNA等转录本的研究，能够全面、深入和细致地分析一种生物的组织或细胞的基因组、转录组，因此又被称为深度测序[24]。

RNA-Seq 最初由 Ugrappa Nagalakshmi等[25]和Zhong Wang等[26]分别发表了利用RNA-Seq技术阐述裂殖酵母（fission yeast）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）转录组的研究论文，标志着该技术的建立，极大地推动了许多非模式植物、农作物和经济作物的全基因组测序工作。因该技术可以获得全部转录本的丰度信息及具有较高的准确度，故能够应用于瓜菜功能基因组学研究，且在瓜菜作物抗逆、抗病基因发掘和种质资源评估应用方面前景广阔。

相较传统的测序技术而言，RNA-Seq因具有高通量、低成本、对物种遗传背景和灵敏度要求较低、重复性好、精确度高、不需要太大的RNA量且可检测到低至几个拷贝的转录本等特点，从而表现出其独特的优越性，日渐成为转录组研究的主要方法[27-29]。RNA-Seq已广泛涉及营养、发育阶段、病原物、非生物胁迫等研究领域，对于获得物种或组织的转录本信息及转录本上基因的相关信息、发现新基因和可变剪切以及进行基因结构优化和基因表达差异分析等[30-33]均具有促进作用。

2 转录组学技术在瓜菜作物上的应用

转录组学技术因具有测序通量高、时间短且成本低、信息量大等优势，现已被广泛应用于瓜菜作物转录组的研究中，如辣椒（Capsicum annuumL.）[34]、南瓜（Semen cucurbitae）[35]、西葫芦（Cucurbita pepoL.）[36]、西瓜（Citrullus lanatus）[37-38]、黄瓜（Cucumis sativusL.）[39]、甘薯（Ipomoea batatas）[40]、大蒜（Allium sativumL.）[41]、西兰花（Brassica oleracea）[42]、番茄（Solanum lycopersicum）[43-44]等作物。这些研究运用RNA-seq技术，有助于发现瓜菜作物转录组的重要基因和SSR分子标记。此外，瓜菜作物在受到生物和非生物因素影响后，会引起自身代谢失衡等生理状态的变化，而运用转录组学方法，可以研究特定时间、特定状态下内源因子和外源因子调控的基因表达差异情况，在瓜菜非生物胁迫和抗病机制研究应用方面前景广阔。

2.1 非生物胁迫条件下转录组学技术在瓜菜作物上的应用

非生物胁迫如干旱、高盐、冷害、高温、水涝等会影响植物水分、光合、呼吸、物质代谢等过程，进一步诱导植物相关基因的表达，最终积累某些物质并改变其代谢途径。而植物为了生存下来，在长期的系统发育中逐渐形成了对逆境的众多的适应和抵抗机制，转录水平上的基因表达和调控则在其中发挥重要作用[45]。研究非生物胁迫条件下植物的基因表达谱也已成为第二代测序技术的重点应用领域，在瓜菜作物的研究上也逐渐广泛开展起来。

陈嘉贝[46]采用RNA-Seq技术，对盐胁迫处理前后的甜瓜进行了转录组分析，发现大量转录因子表达发生了显著变化。通过测定这些转录因子表达的特性和规律，为更好地理解甜瓜对盐胁迫响应的分子机制以及对作物耐盐机制的认识提供参考。卢坤等[47]通过Illumina测序技术分析鉴定到3 657个油菜叶片干旱胁迫应答相关基因，经过GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，显著富集到 ABA（abscisic acid）刺激响应的基因，揭示了油菜抵抗或适应外界干旱环境在转录水平上依赖ABA合成和信号转导，以提高体内渗透调节物质和抗氧化物质合成基因的表达水平，这与Zhang等[48]对其他植物抗旱机制的研究结果一致。证实了ABA信号转导和次生代谢途径对油菜干旱胁迫抗性的重要性。尹波[49]借助RNA-Seq技术测定了高温处理前后的番茄植株转录组动态变化，筛选到大量受高温胁迫的基因。这些基因参与环境应答、转录调控、代谢、信号转导等一系列应答过程，揭示了番茄高温胁迫下转录组水平的复杂的调控网络。此外，有关瓜菜作物耐钾、耐寒的转录组研究也有相关报道[50-51]。

瓜菜抗逆转录组和表达谱研究表明，参与胁迫响应的基因可通过调控涉及信号受体、转导及转录调节类蛋白编码的基因表达以及调节编码具有保护功能产物基因的表达，最终合成抗逆代谢物相关蛋白，从而提高作物的胁迫耐受性。

2.2 瓜菜作物与病原菌互作的转录组学研究

在与病原菌互作研究领域，转录组学技术现已广泛应用于各种瓜菜作物的病害研究。

Tan 等[52]对黄萎病菌（Verticillium dahliae）诱导的番茄根系中提取到的mRNA建立cDNA文库进行RNA-seq分析，共筛选到1 953个显著的差异表达基因，GO、COG（Cluster of Orthologous Groups）和KEGG富集分析发现，这些基因参与生物调节、次级代谢、信号转导、苯丙烷代谢及植物-病原互作途径，为挖掘防御相关基因及深入解析番茄与黄萎病菌互作机制提供广泛的数据支持。Kong等[53]对灰霉病（Botrytis cinerea）诱导前后的黄瓜转录组研究中，发现了3 512个差异表达基因，经过GO功能注释和KEGG代谢途径分析，筛选到一些包括参与ABA、ET、生长素以及谷胱甘肽代谢（GSH）途径的基因，这些基因在黄瓜抗灰霉病中发挥重要作用，这与前人对番茄灰霉病的抗性机制的研究结果一致[54-59]。Gyetvai等[60]分析了马铃薯晚疫病（Phytophthora infestans）侵染寄主后的转录组表达谱，发现在寄主与病原菌亲和互作过程中，一些基因出现了不同程度的上调或下调，较为明显的是，病原相关基因上调表达，光合作用功能基因及CO2固定相关基因下调表达，这可能是病原菌侵入寄主后，抑制了寄主植物的生长，之前的研究结果也得出较为一致的结论[61]。单春会[62]运用转录组学技术对未侵染（0 h）和被青霉菌侵染（48 h和60 h）的哈密瓜果实进行了转录组分析，发现数个病原菌相关分子受体（PAMP）和抗病相关基因表达量均存在差异，较为深入地揭示了哈密瓜对青霉菌侵染的应答机制。

寄主植物受病原菌胁迫后，寄主细胞利用自身免疫受体（抗病蛋白）能够识别病原菌效应因子，通过激活一些参与抗病相关途径基因的表达，诱发寄主细胞自身抗病反应，进而实现对病原菌胁迫信号的响应、传递以及生物学防御。辣椒受黄单胞菌（Xanthomonas vesicatoria）侵染后，其自身可识别黄单胞菌的效应因子，并通过基因Bs4C调控黄单胞菌类转录激活因子效应蛋白AvrBs4的识别，从而对病原菌起到一个防御的效果[63]。Du[64]等通过RNA-seq技术研究了番茄抗感品系接种细菌性疮痂病（Xanthomonas perforans）6 h和6d的差异表达基因变化，筛选到植物激素信号转导、植物-病原互作、苯丙氨酸代谢等抗病相关途径的基因，为充分了解番茄与疮痂病菌互作机制提供数据支持。

瓜菜作物的抗病性由多基因协同作用，通过一系列基因的表达调控来实现。瓜菜作物-病原菌互作过程中启动的差异表达基因体现了作物对病原菌效应子的识别、抗病信号级联传递及抗病防御系统的激活等关键信息，通过获得这些信息能够有助于全面深入了解作物的抗病机制。

3 展 望

转录水平调控是生物体最主要的调控方式，对生物体细胞RNA的调控机制研究可以从基因组水平上进行。就目前来看，转录组测序技术正逐步取代传统测序方法（如基因芯片技术）而成为研究基因的主要手段。现阶段，转录组学技术因其低成本和方便性受到广泛重视和应用。对生物胁迫和非生物胁迫处理后的瓜菜作物进行转录组测序，并结合生物信息学方法对转录本进行分析，包括基因功能的注释、特异表达基因的筛选、抗逆代谢通路的研究以及一些新基因的发掘，便于弄清楚这些基因在瓜菜作物的生理和病理方面担任的角色以及瓜菜作物对生物和非生物耐受性的分子机制，进一步为瓜菜作物功能基因组学的发展奠定基础。

转录组学技术的发展为瓜菜作物转录组学研究提供了新的技术手段，使瓜菜作物转录组研究进入到一个快速发展的阶段。目前在实际应用中转录组学研究面对的主要问题是如何高效的挖掘功能基因。一方面是因为基因的转录丰度与基因表达产物的活性没有必然的联系，用基因表达量的变化来反映生理及分子机制不具备十足的严谨性，给转录组学的应用带来了挑战。另一方面是转录本所反映的基因信息与基因表达信息的一致性问题。这些问题都困扰着转录组学的发展。因此，通过转录组学技术研究的瓜菜基因变化来解释瓜菜抗逆机制应变得慎重。在研究瓜菜作物抗逆机制方面，有必要将转录组学和蛋白组学结合起来，以提高信息分析的准确性和真实性。随着时代的发展，转录组学技术必将受到广泛青睐，成为瓜菜作物研究领域比较成熟且比较常规的分子手段之一。瓜菜作物转录组学也会在抗逆、抗病机制研究、品种选育和种质资源鉴定方面不断前进。