头状茎点霉病菌的新寄主高粱及病菌的检疫鉴定

王 颖，程颖慧，汪 莹，高瑞芳，章桂明，史亚千，王红英

（1.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东 深圳 518045）



头状茎点霉病菌的新寄主高粱及病菌的检疫鉴定

王 颖1，2，程颖慧1，2，汪 莹1，2，高瑞芳1，2，章桂明1，2，史亚千1，王红英1

（1.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东 深圳 518045）

摘 要：从进境美国高粱种子中分离到1种真菌，通过用不同培养基培养，观察菌落特征及病原菌形态特征，进行形态学鉴定；并结合分子生物学方法选取了目前常用的能够用于对Phoma属不同种进行区分的4个基因片段ITS、TUB、ACT和TEF进行PCR扩增、产物序列测定及比对分析，同时应用柯赫氏法则进行致病性测定，结果均表明该真菌为头状茎点霉病菌Phoma glomerata。此病原真菌在高粱上发现属于首次报道。该病菌是我国进境植物检疫性有害生物，寄主范围十分广泛，但在高粱中未发现有为害的报道，此次检出可判定高粱为该病菌的世界新寄主。

关键词：高粱；Phoma glomerata；检疫鉴定；新寄主

头状茎点霉﹝Phoma glomerata（Corda）Wollenweber & Hochapfel﹞又名葡萄茎枯病菌，英文名Phoma spot，系黑盘孢目（Sphaeropsidales）球壳孢科（Sphaeropsidaceae）茎点霉属（Phoma）真菌，是我国进境植物检疫性有害生物，美国、意大利、希腊、瑞典、印度、澳大利亚、以色列、秘鲁、巴西、匈牙利、加纳、南非、伊朗、中国等国家均有分布［1-8］，并且寄主范围广，能为害柑桔属、苹果、亚洲栽培稻、松属、豌豆、黑麦、茄属、马铃薯、普通小麦、蚕豆、葡萄等近100种寄主植物，造成寄主植物根、茎、叶及果实发病，如可在葡萄上引起茎枯、小麦叶斑等。叶片和果实上的斑点不规则，黄色或淡褐色，病斑长1～6 mm、宽1 mm。在高粱上没有发生为害的报道。病菌可在颖片、果实和植物病残体中存活。可通过风雨传播，远距离通过种子、土壤和繁殖材料传播。本研究从美国进境高粱种子中分离到菌株，采用真菌形态学和分子生物学及致病性测定等多种方法进行确凿鉴定，是在高粱上发现头状茎点霉的首次报道。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离培养

供试高粱样品为船运散装美国高粱，进境日期为2015年2月6日，货物重量为53 757 t。按照SN/T 3682-2013《葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法》［2］对送检样品进行外观检查，挑取异常的高粱种子约500粒在25℃条件下保湿24 h，然后在-20℃冷冻24 h，用75%乙醇表面灭菌90 s，无菌水清洗3次后吸干水分，放置在PDA培养基上，25℃条件下黑暗培养，3 d后开始观察。用解剖镜观察，如发现有菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝至PDA培养基上纯化。将疑似P. glomerata分离物（2015SOU26）分别转到PDA培养基、OA培养基、MEA培养基和高粱培养基上，25℃条件下黑暗培养，7 d后观察记录菌落正、反面的颜色、气生菌丝的疏密程度及菌落特征，并测定病菌的生长速度、分生孢子器大小、分生孢子大小等。继续培养25 d观察记录厚垣孢子的形态特征、大小等。

1.2 分子生物学方法

1.2.1 菌丝DNA提取 用灭菌针刮取在PDA培养基上培养7 d的培养物，于研钵中液氮冷冻后研磨，采用植物总DNA提取试剂盒提取病原菌总DNA，置于-20℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增及序列测定 选取目前常用的能够用于对Phoma属不同种进行区分的4个基因片段ITS、TUB、ACT和TEF进行PCR扩增及序列测定［9-14］。分别采用ITS4/5［9］、ACT-783R/ACT-512F［10］、TUB2Fd/TUB4Rd［11］、EF1-728F/ EF1-986R［12］4套引物扩增ITS区、Actin基因、β-tubulin基因及翻译延长因子TEF等4个基因片段，并进行双向测序。PCR反应体系为25 μL，其中含10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq聚合酶1 U（大连宝生物），引物各0.2 mmol/L，模板DNA 为10 ng。PCR扩增程序为95℃预变性5 min；进入循环：95℃ 30 s，ITS4/5、ACT-783R/ACT-512F、TUB2Fd/TUB4Rd、EF1-728F/EF1-986R退火温度依次为58℃、52℃、55℃、55℃ 30 s，72℃ 80 s；72℃ 7 min。

1.2.3 序列比对及分析 在NCBI网站上对培养物测序所得的4个基因片段ITS、Actin、β-tubulin 及TEF序列进行Blast比对分析，确认分离物DNA序列与GenBank上相关物种序列的相似度。

1.3 致病性测定

1.3.1 高粱苗致病性测定 选用栽培17 d长出两叶一心或三叶一心的高粱苗进行接种实验。先用75%酒精棉球对预备接种的叶片进行消毒，用无菌的注射针针刺梅花点，分别取培养5 d的 2015SOU26菌株菌丝块和孢子悬浮液（8 700个孢子/μL）进行接种，以无菌水和无菌的PDA培养基块作对照，用塑料袋套保湿72 h，室温培养。

1.3.2 小麦苗致病性测定 选用栽培12 d长出两叶一心的小麦苗进行接种实验。先用75%酒精棉球对预备接种的叶片进行消毒，用无菌注射针针刺1～3个点，取培养5 d的2015SOU26菌株菌丝块进行接种，以无菌的PDA培养基块作对照，用塑料袋套保湿72 h，室温培养。

1.3.3 大豆苗致病性测定 选用栽培15 d的大豆苗进行接种实验。先用75%酒精棉球对预备接种的大豆茎基部进行消毒，用无菌注射针针刺梅花点，分别取培养5 d的2015SOU26菌株菌丝块和孢子悬浮液（8 700个孢子/μL）进行接种，以无菌水和无菌的PDA培养基块作对照，用塑料袋套保湿72 h，室温培养。

2 结果与分析

2.1 菌落特征

菌落在PDA培养基生长最快，培养7 d生长74.7 mm。菌落在PDA和OA培养基上均有轻微耸立的菌丝体，菌落边缘颜色稍浅，灰色至橄榄绿色；在MEA培养基上菌落中央因产生大量分生孢子溢浓而呈浅橙色，菌落边缘白色，气生菌丝浓密呈羊毛状；在高粱培养基上，菌落橄榄绿色，边缘颜色稍浅（图1，封三）。

2.2 形态特征

菌落上产生大量分生孢子器，分生孢子器在培养基上表生或半埋生，分生孢子器球形、半球形或倒洋梨形，有乳头状突起，通常单生，后期聚生，直径为50～300 μm；分生孢子器初期释放出浅粉色分生孢子液，后期颜色变深成浅橄榄色。分生孢子单细胞，无色透明，椭圆形至近圆柱形，直或向内稍弯曲，有油球，多为2个，老熟的分生孢子变成浅褐色，分生孢子壁稍粗糙。测量30个孢子，大小为2.37～3.17 μm×5.40～7.18 μm，平均为2.76 μm×6.22 μm；厚垣孢子在形状和大小上变化很大，通常多细胞砖格状，形成分枝或不分枝的孢子链，偶有独立单生，厚垣孢子起初光滑，后期粗糙，浅褐色至深褐色，测量30个厚垣孢子，大小为13.60～30.67μm×23.34～60.00μm，平均为20.95 μm×35.31 μm，见图2、图3（封三）。

2.3 DNA 序列比对分析

经在GenBank中进行Blast分析，结果表明ITS片段与GenBank中葡萄茎枯病菌FJ427017.1 等33条序列同源性为100%，ACT基因序列与GenBank中葡萄茎枯病菌FJ426896.1等序列同源性为100%，TUB基因序列与GenBank中葡萄茎枯病菌FJ427115.1等序列同源性为100%，TEF基因序列与GenBank中葡萄茎枯病菌EU543969.1等序列同源性为99%。

2.4 致病性测定

将菌株2015SOU26分别接种高粱、小麦、大豆，接种后15 d发现高粱叶片、小麦叶片、大豆茎秆均发病。高粱、大豆接种部位变为黑褐色病斑，小麦接种部位褪绿、黄化，对照植株均无上述症状，见图4（封三）。对发病植株进行病原菌再分离，所有发病部位均分离到该病菌。

3 结论与讨论

通过观察分离物菌落性状及形态学特征完全符合行业标准SN/T 3682-2013《葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法》等［2，15-16］对该病菌的判定依据，致病性测定表明该病菌能够人工侵染高粱叶片、小麦叶片及大豆茎秆，经序列分析和与GenBank中P. glomerata比对表明本次分离菌的ITS、TUB、ACT 和TEF与已经登录的葡萄茎枯病菌相应序列高度一致。综上所述，从美国高粱中截获的病原真菌为葡萄茎枯病菌，虽然现有的文献资料未见该病菌在高粱上发生为害的报道，但是由于该病菌寄主范围广泛，生存能力极强，不排除其在高粱上发病的可能性，本次从高粱上分离截获到该病菌可判定高粱为该病菌的世界新寄主。

传统的真菌鉴定，以形态学为依据，通过直接镜检、培养后菌落特征、孢子形态、大小等进行鉴定。但是由于有些真菌产孢时间长或不易产孢及形态变异较大，对准确鉴定造成一定的困难。20世纪80年代至今，分子生物学技术得到了长足的进步，其中DNA 序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。序列测定是对致病真菌分类鉴别的重要手段。目前ITS区最常用于真菌的分类研究，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，但是针对Phoma属真菌，ITS区就不能完全区分各个种间差异，需要利用一些蛋白编码区，如β-微管蛋白基因（β-tubulin gene）、肌动蛋白基因（Actin gene）、延长因子-1α基因（EF-1α钙调蛋白基因（calmodulin gene）等序列分析把菌株鉴定到种水平。P. glomerata为我国进境植物检疫性有害生物，是我国首次从美国进境高粱上检疫截获。本次鉴定依据为行业标准SN/T 3682-2013《葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法》［2］，由于该病菌在高粱上没有发生为害的报道，慎重起见，检疫人员根据文献报道［11-14］，选取了目前公认的能够用于对Phoma属不同种进行区分的4个基因片段进行序列分析，并完成致病性测定试验，以准确鉴定P. glomerata。

我国虽然在一些寄主上有报道［3-8，17-22］，其中一些为植物内生真菌，但未做致病性测定，与此次从美国高粱上截获的P. glomerata致病性有可能存在差异，有必要作进一步研究。

参考文献：

［1］ Farr D F，Rossman A Y. Fungal Databases，Systematic Mycology and Microbiology Laboratory，ARS，USDA ［EB/OL］. http：//nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/ index.cfm，2016.

［2］ 贺艳，赵良娟，段维军，等. 葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法（SN/T 3682-2013）［S］. 北京：中国标准出版社，2014.

［3］ Wang X，Wang J，Gao J，et al. First report of leaf spot disease on Schisandra chinensis caused by Phoma glomerata in China［J］. Plant Disease，2012，96：289.

［4］ Zhao D，Kang Y B. First report of branch blight of tree peony caused by Phoma glomerata in China［J］. Plant Disease，2013，97：1114.

［5］ 田蕴慧，薛梦林，赵国柱，等. 冬枣贮藏期病害病原菌的鉴定［J］. 果树学报，2010，27（3）：422-426.

［6］ Gao L L，Zhang Q，Sun X Y，et al. Etiology of moldy core，core browning and core rot of Fuji apple in China ［J］. Plant Disease，2012，97（4）： 510-516.

［7］ 王雪，王晶，高洁，等. 五味子褐斑病病原菌生物学特性研究［J］. 北方园艺，2013（7）：142-145.

［8］ 白飞荣，刘洋，李辉，等. 香山黄栌枯萎病叶片真菌的分离与鉴定［J］. 生物学通报，2014，49（5）：51-53.

［9］ White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplicication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR protocols：Aguide to methods and applications［M］. San Diego：Aeademic Press，1990：314-322.

［10］ Carbone I，Kohn L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes ［J］. Mycologia，1999，91：553-556.

［11］ Aveskamp M M，Verkley J M，De Gruyter J，et al. DNA phylogeny reveals polyphyly of Phoma section Peyronellaea and multiple taxonomic novelties［J］. Mycologia，2009，101（3）：363-382.

［12］ Druzhinina I，Kubicek C P. Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea：from aggregate species to species cluster［J］. Journal of Zhejiang University Science，2005，6B：100-112.

［13］ Aveskamp M M，De Gruyter J，Woudenberg J H C，et al. Highlights of the Didymellaceae：A polyphasic approach to characterize Phoma and related pleosporalean genera［J］. Studies in Mycology，2010，65：1-60.

［14］ László IRINYI，György János KÖVICS，Erzsébet SÁNDOR. Taxonomical re-evaluation of Phoma-like soybean pathogenic fungi［J］. Mycological Research，2009，113：249-260.

［15］ Boerema G H，De Gruyter J，Nordeloos M E，et al. Phoma Identification Manual［M］. London：CABI Publishing，2004.

［16］ Morgan-Jones G. Phoma glomerata. CMI Descriptions of pathogenic fungi and bacteria［M］. Wallingford，UK：C.A.B. International Mycological Institute，1967：134.

［17］ 钱龙，杨明飞，冉雪琴，等. 银杏产黄酮内生真菌的分离与鉴定［J］. 山地农业生物学报，2007，26 （4）：305-310.

［18］ 路浩，卢围，赵宝玉，等. 我国主要疯草内生真菌分离鉴定及其进化分析［J］. 中国兽医学报，2012，32 （12）：1819-1827.

［19］ 臧威，孙翔，孙剑秋，等. 南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构［J］. 应用生态学报，2014，25 （7）：2071-2078.

［20］ 贾敏，蒋益萍，张伟，等. 浙江天目山和建德地区产银杏中内生真菌多样性的比较研究［J］. 现代药物与临床，2014，29（3）：262-268.

［21］ Sun X，Guo L D，Hyde K D. Community composition of endophytic fungi in Acer truncatum and their role in decomposition［J］. Fungal Diversity，2011，47：85-95.

［22］ 杨忆，武海燕，李朋华，等. 新郑灰枣枣果内生真菌的分离和鉴定［J］. 菌物学报，2015，34（1）：164-168.

（责任编辑 杨贤智）

Sorghum as a new host of Phoma glomerata and identification of this pathogen

WANG Ying1，2，CHENG Ying-hui1，2，WANG Ying1，2，GAO Rui-fang1，2，ZHANG Gui-ming1，2，SHI Ya-qian1，WANG Hong-ying1
（1. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518045，China；2. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine，Shenzhen 518045，China）

Abstract：The isolate 2015SOU26 was intercepted from sorghum imported from American in Shenzhen port. The methods of morphology，pathogenicity，sequencing，including ITS，TUB，ACT，TEF that usually used in indentifying Phoma and blast analysis were used in this study. The results indicated that the isolate was Phoma glomerata. The pathogen is the first report in sorghum，and it is a plant quarantine disease in China. Its host range is very extensive，but no damage report is found in sorghum，this result can preliminary judge that the pathogen has new host：sorghum in the world.

Key words：sorghum；Phoma glomerata；identification；new host

中图分类号：S41-30

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）02-0098-04

收稿日期：2015-11-05

基金项目：国家质量监督与检验检疫总局项目（2014 IK008，2015IK267）

作者简介：王颖（1968-），女，硕士，研究员，E-mail：mswy2008@163.com