锦鲤疱疹病毒(KHV)的检测技术概述

张圆圆 王先科 贾 滔

（河南省水产科学研究院 450044）

锦鲤疱疹病毒(KHV)的检测技术概述

张圆圆 王先科 贾 滔

（河南省水产科学研究院 450044）

本文介绍了锦鲤疱疹病毒（KHV）的临床感染症状和5种检测手段，包括PCR检测法、细胞培养分离法、透射电镜观察法、ELISA检测法、间接免疫荧光检测法（IFAT）等，旨在通过进一步了解锦鲤疱疹病毒病的发病机理，为KHV病毒株的分离纯化以及相关疫苗的研制提供参考。

KHV；症状；检测；分离

锦鲤疱疹病毒(Koiherpersvirus，KHV），又称鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-Ⅲ),是锦鲤疱疹病毒病的主要病原，传染性强，死亡率高，可引起锦鲤、鲤及变种框镜鲤的鱼苗、幼鱼和成鱼大量死亡。世界卫生组织（OIE)将其列为必须申报的疾病，我国将其列为二类疾病。

鲤鱼是河南省渔业主要养殖品种，也是渔民的主要收入来源之一。近年来频繁暴发的锦鲤疱疹病毒病发病快，覆盖面广，死亡率高，严重威胁着河南省渔业的发展。2015年郑州东部及中牟等地出现多起较严重的大面积死亡，洛阳、商丘等地也出现不同程度的发病情况，对养殖户造成严重的损失。目前尚未有效的药物能够控制该病情，养殖户对此“谈虎色变”。笔者现将国内外已经成熟的锦鲤疱疹病毒检测技术总结如下，旨在通过对不同的检测方式的概述，进一步了解锦鲤疱疹病毒病的发病机理，为KHV病毒株的分离纯化以及相关疫苗的研制提供参考。

1 临床症状

发病鱼及潜在发病的鱼具有以下症状：游动缓慢，平衡能力失调，多在鱼塘周围漫游；肉眼可观察到头盖骨凹陷，眼球凹陷，鳃丝发白，糜烂或坏死，黏液增多；体表黏液增多，皮肤出现不规则出血症状。解剖后发现中后肾充血、肿大；肝胰脏失血严重，镊子触碰时易碎；脾脏充血，呈紫红色。

2 锦鲤疱疹病毒病原的检测方法

目前有效的检测和诊断手段主要包括：PCR检测、细胞培养分离、电镜观察、ELISA（酶联免疫吸附测定）和免疫荧光检测法等。

2.1 PCR检测

2.1.1 常规PCR检测

根据世界动物卫生组织（OIE）推荐的引物，目前已扩增出的KHV片段有两种，分别为TK（KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因）和Sph（KHV聚合酶基因）。疑似濒死病鱼解剖后，取鳃、肝胰脏、肾脏、脾脏和脑等组织混合样，冰浴匀浆，常规方法提取DNA、PCR及凝胶电泳分析。TK基因大小409bp,扩增所需引物序列为：上游引物:5’-GGGTTACCTGTACGAG-3’,下游引物：5’-CACCCAGTAGATTATGC-3’。PCR反应条件：94℃预变性5min；95℃变性1min、51℃退火1min、72℃延伸1min，40次循环；72℃延伸10min。

Sph基因大小292bp,扩增所需引物序列为：上游引物5’-GACACCACATCTGCAAGGAG-3’，下游引物5’-GACACATGTTACAATGCTCGC-3’，PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s、63℃退火30s、72℃延伸30s，40次循环；72℃延伸7min。

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，同时设定阴性、阳性对照。

2.1.2 nest-PCR（嵌套式聚合酶链式反应）检测

nest-PCR主要用于对潜在的KHV病毒进行检测。常规方法提取DNA后PCR，将第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板进行扩增。一轮PCR引物为长引物，扩增484bp的片段，二轮PCR引物为短引物，扩增一轮PCR产物中412bp的片段。其中引物序列设计如下：

一轮上游引物：

5’-GACGACGCCGGAGACCTTGTG-3’

一轮下游引物：

5’-CACAAGTTCAGTCTGTTCCTCAA-3’

二轮上游引物：

5’-GCCGGAGACCTTGTGATAGA-3’

二轮下游引物：

5’-CCCACGTGCAACTTTGACCC-3’

将二轮PCR产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，同时设定阴性、阳性对照。

2.1.3 LAMP（环介导等温扩增）法

LAMP（loop-mediated isothermal amplification）是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术主要是利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，让引物可以在等温条件下（约65℃)顺利结合进行链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，大大节省了时间，同时因为两对引物针对靶基因6个区域，LAMP具有极高的扩增特异性。该技术在65℃下，60min内能扩增出109-1010个拷贝，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光就能得出结果，简单、快速、廉价，特别适用于现场快速大量的检测。

目前针对KHV检测的LAMP技术已经基本成熟，反应体系如下：

上游内引物KHV-FIP:5’-CCCAAACCCAAGAA -GCAGAAACCCGTTGCCTGTAGCATAGAAGA-3’

下游内引物KHV-BIP:5’-CACTCCCTCCGATG -GAGTGAAACTGCCCATGTGCAACTTTG-3’

上游外引物KHV-F3:5’-CTGTATGCCCGAGAG -TGC-3’

下游外引物KHV-B3:5’-AACTCCATCGCCGTC -ATG-3’

环引物KHV-LF:5’-CCCGCCGCCGCA-3’

常规方法提取DNA后，加入引物、反应液进行反应，65℃下反应60min，肉眼观察浊度或者荧光判断结果即可。

2.2 细胞培养与分离法

目前，国内外常用锦鲤鳍条细胞系KF和普通鲤鱼脑细胞系CCB进行KHV病毒培养和分离。根据已有的报道，国内于2011年首次分离出锦鲤疱疹病毒，之后，在武汉、广州等地也相继分离出KHV。

采集新鲜病鱼的肝、肾、脾、鳃及脑等组织混合样，在无菌条件下以1:8的重量体积比加入含1%双抗的灭菌PBS，在冰浴上匀浆后-80℃下反复冻融，4℃下以 3000rpm、6000rpm、9000rpm依次离心各10min，在超净工作台上取1ml上清加入到含单层CCB或KF细胞系的培养瓶中，加入含10%血清的培养基，放入25℃生化培养箱中培养，每天观察CPE情况。感染KHV的细胞体积增大，并出现大量的细胞质空泡，细胞单层崩解，细胞发生融合。

2.3 透射电镜观察法

取待测病鱼的鳃丝、肝胰脏、脾脏、肾脏及脑等组织混合样，剪成0.5cm2大小的组织块，用2.5%戊二醛溶液固定，磷酸缓冲液清洗，再用1%锇酸溶液固定2h，梯度乙醇脱水，苯二甲酸二丙烯酯包埋，常规电镜超薄切片染色，透射电镜观察并拍照。KHV感染过的样本细胞体积增大，出现大量的空泡，并且能够在细胞质中观察到大量成熟和未成熟的病毒粒子。

2.4 ELISA检测

该方法以纯化的KHV作为抗原包被酶标板，检测鱼血清中的KHV抗体，是判断外表健康鱼是否感染KHV的有效方法。该法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点，为我国锦鲤疱疹病毒病的监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。具体操作过程如下：

首先包被纯化的KHV病毒，封闭1h后用PBST 洗3遍，加入待测血清孵育,同时设置阴性和阳性对照；接着加入IgM抗体孵育1h，再加入HRP标记羊抗鼠抗体IgG,最后加入TMB显色液，待阳性出现条带加入终止液,测定吸光值(OD）数值，即可评估待测KHV的含量。

2.5 间接免疫荧光检测法（IFAT）

免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

间接免疫荧光法检测KHV 方法如下：CCB细胞接种至96孔板，细胞长到90%时加入疑似病样组织滤液，25℃培养箱孵育至出现CPE，吸弃培养液，室温下加入-20℃预冷的甲醇固定10min，PBS洗涤3~4次；0.5%Triton处理10min，PBS洗涤3~4次；37℃下5%BSA处理30min，PBS洗涤3~4次，然后分别加入鼠抗KHV一抗、羊抗鼠二抗各孵育1h，PBS洗涤3~4次，倒置荧光显微镜下观察，感染KHV的病样会在显微镜下观察到大量的绿色荧光。

3 小结

目前全国各地通过各种检测手段进行KHV的检测和分离，但是面临的共同问题就是在疑似病例中KHV阳性检出率偏低。笔者认为，为了提高阳性检出率，可以从以下几个方面进行改进：

3.1 采样时需分清细菌性败血症引起的急性烂鳃病和锦鲤疱疹病毒引起的急性烂鳃病，只有由锦鲤疱疹病毒引起的急性烂鳃才会检测出KHV。

3.2 取样的时候尽量取新鲜活体样本，带回实验室后尽快检测，冻存的样本影响DNA的检测。

3.3 对于症状比较明显的样本可以采用一种方法进行检测，潜在样本需通过至少2种方法，最终确认是否为KHV阳性。

Overview of detection methods of koi herpesvirus(KHV)

Zhang Yuan-yuan,Wang Xian-ke,Jia Tao

(Henan Academy of Fishery Science,Zhengzhou 450044,Henan,China)

This paper introduced the symptoms of KHV infection and five detection methods,including PCR, cell culture and separation,TEM observation,ELISA,IFAT.It aimed to probe the disease mechanism of KHV and offer reference for KHV separation and related vaccines development.

KHV;symptoms;detection;separation

现代农业产业技术体系建设专项（nycytx-49-34),河南省农业产业技术体系（：2060302-社会公益研究）

张圆圆（1986-），女，汉族，硕士研究生，从事渔业资源调查和病害防控工作