转基因植物DNA成分检测技术研究进展

林馥芬 侯红利，2 刘 晋，2 王学林，2 邓汉超，2 周向阳，2

（1广东省深圳市农业科技促进中心，深圳518040；2农业部农作物种子质量监督检验测试中心（深圳），深圳518040）

转基因植物DNA成分检测技术研究进展

林馥芬1侯红利1，2刘 晋1，2王学林1，2邓汉超1，2周向阳1，2

（1广东省深圳市农业科技促进中心，深圳518040；2农业部农作物种子质量监督检验测试中心（深圳），深圳518040）

综述了转基因植物的DNA成分定性、定量检测，基因芯片检测技术的原理和特点，初步探讨未知转基因核酸成分检测技术研究状况，最后指明转基因检测技术 的发展依赖于 现代分子 生物学研究技术的发展，并朝着低成本、自动化、高灵敏度、高特异性、高通量的方向发展。

转基因；PCR；DNA

自从1996年第1个转基因番茄商业化种植后，世界各国开始快速地发展转基因技术，转基因作物及其产业得到迅速扩展，并给农民带来了巨大的经济收益。据统计，20年中（1996-2015年）全球转基因作物累计种植面积已经达到20亿hm2，比我国大陆总面积（9.56亿hm2）和美国总面积（9.37亿hm2）的总和还多[1]。但公众对转基因技术及其产品的认识不够，对转基因植物及产品的安全性存在担忧；虽然我国强制性要求标识转基因产品，但是在标识水平上没有明确说明标识的最低范围。因此，应更进一步地学习和探索转基因产品检测技术，以便更加科学地管理我国的转基因产品。

1 定性PCR检测技术在转基因检测中的应用

1.1 常规PCR检测技术的应用 常规PCR（common PCR）检测是针对特殊序列（如启动子、终止子和遗传标记基因）和目的基因（靶基因）设计引物，进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离、核酸染料染色（如EB、GoldenView等）、紫外成像，判断电泳图像是否含有特异目的条带。T.Matsuoka等[2]对转基因玉米的外源基因进行序列分析，设计针对7种转基因玉米14对特异引物，引物包含转基因玉米启动子、终止子和结构基因。利用设计的引物对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆、水稻、大麦和小麦等进行PCR扩增、电泳检测。试验结果表明，试验设计的引物采用PCR的方法能够快速、准确、特异、有效地检测转基因玉米种子。

1.2 巢式和半巢式PCR检测技术的应用 巢式PCR（nested PCR）检测其原理是通过设计2对特异引物，第2对特异引物在第1对特异引物的扩增序列内，利用第1对特异引物（扩增较大片段）进行20～30个循环的PCR扩增后，其扩增的产物作为模板，采用第2对特异引物进行第2次扩增，对第2次PCR产物进行电泳分离、染料染色、紫外成像，最后判断电泳图像是否含有特异的目的片段。该技术是基于常规PCR技术的基础上发展改良的扩增技术。

半巢式PCR（semi-nested PCR）检测技术，其原理与巢式PCR一样，只是半巢式PCR的第2对特异引物中上游引物或者下游引物是第1对特异引物的引物。

由于食品经过加工，尤其是深加工食品（如豆油、大豆磷脂），其DNA受到很大程度的破坏，难以获得可供利用的有效模板DNA。采用常规PCR检测技术不能完全检出样品是否含有植物内源基因成分和转基因成分，即使检出，也很难重复。与之不同的是巢式PCR和半巢式PCR具有更高的灵敏性、抗干扰能力，能检测到常规PCR不能检测到的水平，而且该方法特异性高，其结果一般不需要再用其他方法来验证[3]。

1.3 多重PCR扩增技术的应用 多重PCR（multiplex PCR）检测技术是设计多个基因的特异引物，并且引物间无交叉反应，将设计的多对引物（1对以上）在同一反应体系下进行PCR扩增，优化反应条件，达到同时针对几个目的基因进行一次性检测的PCR扩增技术。该技术的主要优点是能同时针对多个基因进行一次性检测，检测效率高、简单、准确等。刘光明等[4]设计针对CaMV35S启动子和NOS终止子的特异引物，进行多重PCR检测大豆、马铃薯等样品，结果与常规PCR单个扩增结果一致。V.Carcía-Can～as等[5]对5种转基因玉米进行多重PCR检测，建立了在一个反应体系中同时检测多种转基因玉米的多重PCR检测技术。

1.4 PCR-ELISA检测技术的应用 PCR-ELISA检测技术是PCR技术和ELISA技术的结合，其原理为设计对待检基因的特异引物，同时设计特异引物扩增片段内的特异探针，探针的5′端加入地高辛或生物素等标记，采用特异引物进行PCR扩增，其扩增产物与特异的探针相结合，然后加入抗地高辛或生物素的酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，进行显色反应，判断结果是否显色。PCR-ELISA检测技术的主要特点是检测灵敏度高，相比欧盟推荐的PCR检测方法，提高了5～10倍。由于该方法的优点突出，已广泛地应用于不同的领域，包括转基因成分的检测。然而这项技术操作比较复杂，时间长，使得该技术难以大规模应用于转基因生物的成分检测[6]。

2 定量PCR检测技术在转基因检测中的应用

2.1 竞争性定量PCR检测技术的应用 竞争性定量PCR（competitive quantitative PCR，QC-PCR）检测技术，其主要原理是首先构建与待检测基因相同动力学特点和扩增效率的DNA，该DNA与待测样品的DNA混合在同一反应体系中，进行PCR扩增反应，使它们竞争反应体系中的 底物与引物，待PCR扩增完成后，对产物进行凝胶电泳检测。同时以不同稀释梯度的竞争模板建立标准曲线，通过标准曲线可以计算待测基因的含量。研究人员已经针对35S启动子和NOS终止子在Roundup Ready大豆、Bt11、Bt176玉米等转基因产品上建立了竞争性PCR检测方法[7]。随着研究的不断深入，V.García-Can～as等[8]建立了分析Bt-176转基因玉米的双重竞争定量PCR（Double QC-PCR，DC-PCR）检测方法。A.K.Mavropoulou等[9]通过优化试验，建立了高通量双重竞争定量PCR（High-through DC-PCR，HC-PCR）检测方法，并将该方法应用于转基因成分定量检测分析。

2.2 实时荧光定量PCR技术的应用 实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR）是应用最为广泛的定量PCR检测技术。其基本原理是在PCR扩增的初始过程中，模板DNA的拷贝数的对数值与ct值之间具有线性关系。通过设计分别针对内源基因和目的基因的特异的引物和探针，分别在实时荧光定量PCR上进行PCR扩增，同时采用标准样品或质粒DNA梯度稀释样品绘制标准曲线，采集各个反应的荧光曲线，分别绘制内源基因和目的基因的标准曲线，利用标准曲线方程分别计算待测样品的内源基因和目的基因的拷贝数，最后计算目的基因的量。目的基因的量=目的基因拷贝数/内源基因拷贝数×100%

实时荧光定量PCR技术具有简单、方便、快速、准确等特点，已被广泛应用到动植物、微生物、病毒等的定量检测中，同时也被大量应用到转基因产品的定量检测。M.Vaitilingom等[10]建立对食品中Event Bt176玉米和Roundup Ready大豆的转基因成分的实时荧光定量PCR检测方法，同时将定量检测的检测低限划分为绝对低限、相对低限和实际低限。通过建立的Roundup Ready大豆的转基因成分实时荧光定量PCR检测方法的绝对检测低限为1个拷贝，而实际低限为30个拷贝。

2.3 多重实时荧光定量PCR检测技术的应用 多重实时荧光定量PCR检测技术是多重扩增技术和实时荧光定量技术的整合。常规实时荧光定量检测技术只对1个目的基因进行定量检测，多重实时荧光定量PCR检测技术是对多个（1个以上）目的基因进行同时检测。刘光明等[4]通过设计针对35S启动子和Nos终止子的双重特异引物，采用多重实时荧光定量PCR检测技术对马铃薯、甜椒、番茄、玉米、大豆共11份样品进行检测，其中甜椒1份样品、大豆1份样品、马铃薯2份样品和玉米1份样品同时检测出35S启动子和Nos终止子转基因成分，而剩下6份样品均未检出转基因成分。

3 基因芯片检测技术在转基因检测中的应用

基因芯片（Gene Chip）技术，又称DNA微阵列（DNA microarray），其基本原理是通过设计检测不同目的基因的特异的寡核苷酸探针，探针间高度特异不会产生交叉反应，合成特异的寡核苷酸探针，采用芯片点样仪将寡核苷酸探针固定在一定面积的基片表面上，制备成基因芯片。对待测样品的DNA进行标记，点样到芯片上与芯片进行杂交，杂交、清洗、包埋后的芯片再通过芯片扫描系统进行扫描检测，经过统计分析可以计算出样品含有哪些目的基因。由于芯片能固定大量的针对不同目的基因的寡核苷酸探针，一次检测可同时分析大量的目的基因，因而具有高通量、高特异性、自动化等优点。

基因芯片技术的发展迅猛，迅速地被应用到转基因成分的检测研究中。根据检测目的不同可以将转基因成分检测用的基因芯片分类为普通筛选型芯片、基因特异性检测芯片、构建特异性检测芯片和转化事件特异性检测芯片。J.Xu等[11]设计了针对20个靶基因的20个寡核苷酸探针，制备成DNA芯片。其中该寡核苷酸探针分为3类：第1类探针是普通筛选型探针，针对CaMV 355启动子、CaMV 355终止子、nos启动子、nos终止子、FMV35S启动子、hpt和Nptll等；第2类探针是物种特异性探针，针对不同物种油菜、大豆、棉花、玉米等物种特异性基因；第3类探针是目的基因特异性探针，如Cp4-EPSPS、Cry1Ab等。该基因芯片杂交后分析结果与PCR方法和DNA测序进行比较，结果具有很高的一致性，同时该芯片检测大豆的灵敏度为0.5%、检测玉米的灵敏度为1%。然而，基因芯片虽然具有高通量特性，但是基因芯片的检测成本过高，芯片难以标准化（即不同实验室、不同操作人员做出的结果难以进行统一化、标准化）。同时，还有很多技术难点有待进一步解决，比如如何简化样品制备和标记操作程序，如何提高芯片的特异性，消除芯片背景对于结果分析的影响和增加信号检测的灵敏度等。

4 未知转基因成分检测技术的应用

转基因核酸检测技术为转基因产品的安全检测、安全监督、风险评估提供技术保障。对于未知的转基因产品，其安全风险高，可能对人类健康和环境造成危害，并且PCR方法显然不能直接检测，因此建立新的检测未知转基因技术相当重要，是国际上亟待解决的一大难题。

2005年H.Nesvold等[12]首次对未知转基因技术进行研究，他们设计了一款针对单一物种基因芯片检测模式。该芯片检测模式是利用生物学和组合学的删减原则，设定未知基因芯片探针长度和数量。T.Tengs等[13]对这一技术进一步探索，他们通过分析常用的235个载体，设计长度为25个碱基的探针（共37257条），制成高密度的芯片，采用该芯片对拟南芥和水稻进行检测，结果获得未知转基因序列及其结构信息。然而该技术的缺点是对检测材料的纯度要求较高，检测的结构序列大于140bp并且与已知公认的序列相似。然而，P.Akritidis等[14]在商品化的棉花检测中建立了一种基于事件特异性检测未知转基因检测的方法，通过检测到含有CaMV 35S启动子，然后采用基因组步移策略扩增侧翼序列，扩增产物经过序列测定，获得未知转基因的序列，经序列比对分析，未知转基因棉起源于Monsanto事件1445转基因棉花。

目前对于未知转基因成分检测技术的研究还处在起始阶段，相关的研究报道还很少，由于基因数量多，技术难度高，虽然有一些研究工作者做了探讨，但是技术还不成熟，检测的范围不够广泛，局限性大。高通量、自动化的基因芯片检测技术发展有可能是未来解决未知转基因检测的方法。

5 展望

随着转基因技术的不断发展，转基因产品的数量连年增长，加上贸易国际化的加快，转基因技术及产品被妖魔化，人们对转基因生物的安全性产生担忧，世界各国和地区均纷纷出台针对转基因生物安全的管理制度，建立转基因标识管理制度，有利于转基因植物及其产品的标识和追溯。因此，开展转基因植物及其产品检测方法的研究对保障这些法规实施极其重要。目前，针对转基因产品进行检测，主要是使用定性和定量PCR方法。在PCR检测技术为主导下的转基因成分检测技术，对未知转基因检测技术的研究仍然是未来发展的一个重要方面。由于各种检测技术的交互使用，研究快速、灵敏、自动化、低成本和高通量的新型检测方法已经成为国内外当今的研究热点和发展方向。

[1] Clive J．2015年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势．中国生物工程杂志，2016，36（4）：1-11

[2] Matsuoka T，Kuribara H，Takubo K，et al．Detection of recombinant DNA segments introduced to genetically modifiedmaize．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：2100-2109

[3] Martín-Sánchez J，Viseras J，Adroher F J，et al．Nested polymerase chain reaction for detection of Theileria annulata and comparison with conventional diagnostic techniques：its use in epidemiology studies．Parasitology Research，1999，85：243-245

[4] 刘光明，李庆阁，王群力，等．多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS方法的建立．厦门大学学报：自然科学版，2002，41（4）：493-497

[5] García-Can～as V，González R，Cifuentes A．Semltlve and simultaneous analysis of five transgenic maizes using multiplex polymerase chain reaction， capillary gel electrophoresis，and laser-induced fluoresceace．Electrophoresis，2004，25（14）：2219-2226

[6] Brunnert H-J，Spener F，Borchers T．PCR-ELISA for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified Roundup Ready soybeans．Eur Food ResTechno，2001，213（4）：366-371

[7] Studer E，Rhyer C，Luthy J，et al．Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybean and maize．Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und-Forschung A，1998，207：207-213

[8] García-Cañas V，Cifuentes A，González R．Quantitation of transgenic Bt Event-176 maize using double quantitative competitive polymerase chain reaction and capillary gel electrophorsesis laser-induced fluorescence．Anal Chem，2004，76（8）：2306-2313

[9] Mavropoulou A K，Koraki T，Ioannou P C，et al．High-throughput double quantitative competitive polymerase chain reaction for determination of genetically modified organisms．Anal Chem，2005，77（15）：4785-4791

[10] Vaitilingom M，Pijnenburg H，Gendre F，et al．Real-time quantitative PCR detection of genetically modified maximizer maize and roundup ready soybean in some representative foods．J Agric Food Chemistry，1999，47：5261-5266

[11] Xu J，Miao H，Wu H，et al．Screening genetically modified organisms using multiplex-PCR coupled with oligonucleotide microarray．BiosensBioelectron，2006，22（1）：71-77

[12] Nesvold H，Kristoffersen A B，Holst-Jensen A，et al．Design of a DNA chip for detection of unknown genetically modified organisms（GMOs）．Bioinformatics，2005，21：1917-1926

[13] Tengs T，Kristoffersen A B，Berda K G，et al．Microarray-based method for detection of unknown genetic modifications．BMC Biotechnology，2007， 7：91

[14] Akritidis P，Pasentsis K，Tsaftaris A S，et al．Identification of unknown genetically modified material admixed in conventional cotton seed and development of an event-specific detection method．Electronic J Biotechnology，2008，11（2）：1535-1541

2016-08-30）

国家转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08001-023B）

邓汉超