与胡桃楸茎枝同煮鸡蛋中吸收成分的提取工艺研究

付莹　王添敏　邸学　张慧　初正云　翟延君

【摘 要】 目的：研究胡桃楸茎枝含药鸡蛋中吸收成分的提取工艺，为胡桃楸的抗肿瘤有效成分研究奠定基础。方法：采用不同溶剂提取胡桃楸茎枝的含药鸡蛋提取液作为供试品溶液，以供试品溶液中HPLC峰个数及峰面积总和为评价指标。通过单因素试验对提取溶剂中加酸量、提取方法和提取溶剂种类进行选择，通过正交试验对提取溶剂的浓度、提取溶剂的用量和提取时间进行优化。结果：通过单因素试验确定提取溶剂中不加酸，采用回流提取，提取溶剂为含水丙酮；正交试验确定最佳提取工艺为：50倍量50%丙酮回流提取2h。结论：优选后的提取工艺稳定可靠、合理可行，为研究胡桃楸含药鸡蛋中吸收的成分奠定了基础。

【关键词】 胡桃楸；茎枝；含药鸡蛋；提取工艺；正交设计

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0024-05

Abstract：Objective Eggs cooked with the branches of Juglans mandshurica which was called drug-contained eggs. For the research of constituents absorbed by the drug-contained eggs， this study was conducted to optimize the extraction technology of the drug-contained eggs.Methods For the optimization of acid content added into the extracting solvent， extracting method， and extracting solvent， single factor experiment was designed. Orthogonal experiment was conducted to choose the time of extraction， concentration and volume of the extracting solvent. The total number and the sum of area of chromatographic peak were taken as investigation index.Results The result of single factor experiment demonstrated that acetone and reflux was suitable for the extraction and no acid should be added into the extracting solvent. Orthogonal experiment suggested that the drug-contained eggs should be extracted with 50 times of 50% acetone by reflux for 2 hours. Conclusions The optimum extracting technology is reasonable and stable. This work was useful for the research of the constituents absorbed by the drug-contained eggs.

Keywords：Juglans mandshurica；Branches；Drug-contained eggs；Extraction Technology；Orthogonal Design

胡桃楸始载于《开宝本草》，具有补肺益肾、滋阴助阳、抗癌的功效[1]。民间将胡桃楸与鸡蛋同煮用于治疗肿瘤[2]，轻者吃鸡蛋，重者蛋汤同吃。本课题组前期对与胡桃楸不同部位同煮的鸡蛋（含药鸡蛋）进行抗肿瘤活性研究，发现与胡桃楸不同部位同煮的含药鸡蛋均有不同程度的抗肿瘤作用，其中，茎枝的含药鸡蛋抗肿瘤作用最明显。但尚未发现有关提取含药鸡蛋吸收成分的研究报道。另外，含药鸡蛋中吸收的成分较多，不能以单一成分或某类成分的含量为考察指标，为了全面准确的分析含药鸡蛋中吸收的成分，研究以HPLC图谱中峰个数及峰面积总和为指标，采用单因素试验和正交试验相结合，对与胡桃楸茎枝同煮的鸡蛋中吸收成分的提取工艺进行了优化，为深入研究胡桃楸含药鸡蛋的抗肿瘤作用及胡桃楸的合理开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（G1242B型DAD检测器，美国Agilent公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ALC-110.4万分之一电子天平（赛多利斯）；JA21002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；QF-3800氮气吹干仪（天津市旗美科技有限公司）。

1.2 材料 胡桃楸茎枝样品于2012年10月采自辽宁省普兰店市莲山镇老白山，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为胡桃楸科植物胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.；市售新鲜鸡蛋；乙腈（美国霍尼韦尔公司）、三氟乙酸（TFA，百灵威科技有限公司）、甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司）均为色谱纯；娃哈哈纯净水（杭州哇哈哈纯净水有限公司），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温为30℃；流速1ml/min；检测波长为270nm；进样体积20μl或50μl（根据样品浓度改变）；流动相为0.1%TFA-乙腈和0.1%TFA-水溶液，梯度洗脱程序见表1。

查算供试品溶液的HPLC图谱中色谱峰个数和峰面积总和采用的积分事件参数：斜灵敏度为0.5，峰宽为0.02，最小峰面积为0.5，最小峰高为0.1。峰个数和峰面积总和均除去溶剂峰后进行查算。

2.2 含药鸡蛋的制备 取鸡蛋数枚，称重，加入与鸡蛋等重的胡桃楸茎枝粉末（过40目筛），10倍量水煎煮。鸡蛋蛋白稍凝固后，将蛋壳敲碎继续煮4h。取出鸡蛋，去壳，置搅拌器中加入适量水搅匀，混悬液经冷冻干燥得与胡桃楸茎枝同煮的鸡蛋（含药鸡蛋）粉末。

2.3 供试品溶液的制备 取胡桃楸茎枝含药鸡蛋粉末0.5g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，按照单因素和正交设计实验，加入不同体积、不同浓度的丙酮或乙醇溶液，回流提取2～4h或超声提取1h，提取结束后，滤过，取续滤液5ml，吹干，精密加入10%甲醇1ml溶解残渣，混匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 单因素试验

2.4.1 提取溶剂中加酸量考察 以25ml体积分数为70%的丙酮作为提取溶剂，分别加入体积分数为0、1%、2%、3%的甲酸，按“2.3”项下回流提取2h方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行HPLC分析，考察提取溶剂中加入一定量的酸对供试品溶液中HPLC峰个数及峰面积总和的影响。结果（表2）表明，提取溶剂中不加酸时，供试品溶液中HPLC峰的个数为108个，明显高于其它各加酸组；峰面积总和为3675，也高于其它各加酸组。因此选择提取溶剂中不加酸进行下面提取方法的考察。

2.4.2 提取方法的考察 以25ml浓度为70%的丙酮作为提取溶剂，分别采用回流提取2h、30℃超声提取1h、40℃超声提取1h和50℃超声提取1h，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行HPLC分析，考察不同提取方法对供试品溶液中HPLC峰个数及峰面积总和的影响。结果（表3）表明，采用回流提取时，供试品溶液中HPLC色谱峰面积总和为4217.63，明显高于其它超声提取组；峰个数为97个，也高于其它各超声提取组。因此选择回流提取方法进行下面提取溶剂的考察。

2.4.3 提取溶剂种类的考察 分别以25ml浓度为50%、70%、90%的丙酮溶液和25ml浓度为50%、70%、90%的乙醇溶液作为提取溶剂，按“2.3”项下回流提取2h方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行HPLC分析，考察不同提取溶剂对供试品溶液中HPLC峰个数及峰面积总和的影响。结果见图1，随着丙酮和乙醇浓度的升高，供试品溶液中HPLC峰的个数及峰面积总和均减小，50%丙酮提取效率优于70%丙酮和90%丙酮的提取效率，50%乙醇提取效率优于70%乙醇和90%乙醇的提取效率。比较乙醇和丙酮2种提取溶剂，50%乙醇提取的供试品溶液中HPLC峰个数（127个）略高于50%丙酮提取的供试品溶液中HPLC峰个数（125个），但两者间无明显差异；而50%、70%、90%丙酮提取的供试品溶液中HPLC峰面积总和均高于相应50%、70%、90%乙醇提取的峰面积总和，其中50%丙酮提取的供试品溶液中HPLC峰面积总和最高，为6364.26。因此选择丙酮作为提取溶剂进行下面提取溶剂浓度的考察。

2.4.4 提取溶剂浓度的考察 在提取溶剂种类考察的实验中发现，制备供试品溶液时，随着丙酮和乙醇浓度的降低，滤过的速度明显减慢，此过程增加了提取溶剂的挥发，在一定程度上使续滤液浓度增大，导致低浓度溶剂提取时供试品溶液中HPLC峰面积增大。同时，从图1可知，在选取的丙酮3个浓度中，没有找到提取效率最高的浓度点，仍需向低浓度方向扩大提取溶剂浓度考察的范围。因此在以丙酮为提取溶剂进行溶剂浓度考察时，为了避免续滤液在滤过时浓度变大的影响，供试品溶液制备采用微孔滤膜滤过后直接进行HPLC分析，未进行浓缩，此次实验的HPLC进样浓度为其它实验的1/2，所以峰面积总和也相应减少；为了能够包含提取效率最高的溶剂浓度点，选择30%、50%、70%、90%的丙酮作为提取溶剂浓度考察的范围。

分别以25ml的30%、50%、70%、90%的丙酮溶液作为提取溶剂，按“2.3”项下回流提取2h，提取结束后，上清液经微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行HPLC分析。结果（图2）表明不同浓度丙酮提取效率差异明显，30%丙酮提取供试品溶液的HPLC峰个数（118个）略高于50%丙酮提取供试品溶液的HPLC峰个数（116个），但两者间无明显差异；50%丙酮提取供试品溶液的HPLC峰面积总和为3193.51，明显高于其它各浓度丙酮组。90%丙酮提取供试品溶液的HPLC峰个数及峰面积总和均为最低，提取效率最差，故选择30%、50%、70%的丙酮溶液作为正交试验考察的范围。

2.5 正交试验 在单因素试验基础上，选取丙酮浓度（A）、溶剂用量（B）、提取时间（C）为考察因素，D列为空白列即误差列，用来评估实验的误差。每个因素设定三个水平，采用L9（34）正交试验设计表[3-4]，分析因素及水平见表4。正交设计方案及其结果见表5，根据每个实验号的试验条件，按“2.3”项下回流提取2h方法制备供试品溶液，实验结果以供试品溶液中HPLC色谱峰的个数和峰面积总和为评价指标。

在对正交试验结果进行直观分析时，极差反映了A、B、C三个因素对实验结果影响的程度。极差越大，说明该因素水平变动时，实验结果的变化越大。从供试品溶液HPLC峰个数的极差值（表5）来看，实验中各因素的影响顺序依次为A（丙酮浓度）>C（提取时间）>B（溶剂用量），但是差别较小；从HPLC峰面积总和的极差分析，各因素影响顺序为A（丙酮浓度）>B（溶剂用量）>C（提取时间），其中丙酮的浓度及用量对峰面积总和的影响相对较大，提取时间对峰面积的影响较小。从供试品溶液HPLC色谱峰个数的方差分析来看（表6），丙酮的浓度、用量及提取时间的P值均大于0.3，说明各因素对色谱峰的个数均无显著性影响。从供试品溶液HPLC色谱峰面积总和来看（表7），丙酮浓度的P<0.05，说明丙酮浓度对峰面积总和有显著性影响；提取溶剂用量的P值为0.061，说明溶剂用量对峰面积总和有一定的影响，但影响不显著；而提取时间的P值为0.132，说明提取时间对峰面积总和无显著性影响。

通过直观分析和方差分析结果可知，提取溶剂浓度、用量和提取时间对供试品溶液中HPLC峰个数无显著性影响。而提取溶剂的浓度和用量对供试品溶液的HPLC峰面积总和均有影响，且提取溶剂浓度的影响显著。因此忽略峰个数指标，选择色谱峰面积总和为指标，得到最佳提取工艺组合为A2B2C1，即采用50%丙酮为提取溶剂，溶剂用量为含药鸡蛋的50倍，回流提取2h。此提取工艺也符合实际生产中周期短、成本低等特点。

2.6 提取工艺验证 为了确定提取工艺的稳定性及可靠性，对以上所选的工艺条件进行3批验证实验，结果见表8，HPLC图谱见图3、4。结果表明，供试品溶液中HPLC色谱峰的个数及峰面积总和的RSD分别为1.79%、3.91%，说明该提取工艺结果稳定。最佳提取工艺组合A2B2C1没有出现在正交试验设计表中，通过验证实验发现该提取条件下供试品溶液中HPLC色谱峰面积总和高于正交试验设计表中所选的提取条件，而峰个数与正交试验设计表中所选的提取条件无明显差异，因此最终确定该工艺为最佳提取工艺。

3 讨论

民间将胡桃楸与鸡蛋同煮用于治疗肿瘤，课题组前期研究表明与胡桃楸茎枝同煮的鸡蛋对植于小鼠腋下的H22肿瘤生长具有较明显的抑制作用参考文献。为了明确胡桃楸含药鸡蛋中吸收的成分，本文从胡桃楸与鸡蛋同煮的用法出发，对胡桃楸含药鸡蛋中吸收成分的提取工艺进行了研究。胡桃楸中含有鞣质、萘醌、酚酸和二芳基庚烷等成分[5]，这些成分的结构中都含酚羟基，尤其鞣质类成分易与蛋白质结合。部分成分与蛋白质的结合在一定条件下是可逆的[6]，选择合适的提取条件能够将这些成分提取出来。提取溶剂的种类、pH值、用量以及提取方法、提取时间等均能影响鸡蛋中吸收成分的提取率。因此本文考察了提取溶剂的种类、提取溶剂中加酸量、提取溶剂的浓度、提取溶剂的用量、提取方法和提取时间等6个因素对含药鸡蛋中吸收成分提取率的影响。由于考察因素较多，本文根据具体情况对因素进行了划分，分为单因素试验和正交试验。

提取溶剂pH值主要通过影响成分的解离状态以及破坏成分与蛋白质间的结合力[7]来影响含药鸡蛋中吸收成分的提取率，该因素的影响结果在很大程度上不会受提取方法、提取溶剂和提取时间的影响。提取方法选择回流提取和超声提取，两者对含药鸡蛋吸收成分提取率的影响取决于提取机制的不同[8]，受提取溶剂和提取时间的影响也较小。研究采用单因素试验依次考察提取溶剂加酸量和提取方法对含药鸡蛋中吸收成分提取率的影响。由于胡桃楸中大部分成分的极性较大，提取溶剂比较了极性较大的含水丙酮和含水乙醇，结果各浓度丙酮对含药鸡蛋中吸收成分的提取率均高于相应浓度乙醇组。因此选择丙酮为提取溶剂，通过正交试验对丙酮浓度、提取溶剂用量和提取时间进行了考察。

以供试品溶液中HPLC峰个数和峰面积和为指标，两者之间有一定关联又不完全相同。正交试验的直观分析和方差分析均表明各考察因素对供试品溶液中HPLC色谱峰个数的影响不显著，对峰面积的影响显著。因此以峰面积为指标确定了最佳提取工艺为：提取溶剂为50%丙酮溶液，溶剂用量为胡桃楸枝含药鸡蛋粉末的50倍，回流提取2 h。最后对优选的最佳工艺进行验证，表明该工艺方法简单、提取率高、稳定性好，为胡桃楸含药鸡蛋中吸收成分的研究奠定了良好的基础。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第21卷）[M].北京：科学出版社，1982：33.

[2]贾敏如，李星炜.中国民族药志药[M].北京：中国医药科技出版社，2005：354.

[3]武皓，巩丽丽，杨勇，等.薏苡仁水溶性蛋白提取工艺的优化[J].中药材，2015，38（2）：376-380.

[4]饶双超，冯玲华，姜胜琴.丹归通络颗粒动态逆流提取工艺优选[J].中草药，2015，38（3）：624-626.

[5]管小玉，曲中原，邹翔，等.胡桃楸的化学成分研究进展[J].中草药，2009，40（增刊）：35-38.

[6]石碧，何先祺.水解类植物鞣质性质及其与蛋白质反应的研究[J].皮革科学与工程，1993，3（2）：1-7.

[7]李乐，吴晖，赖富饶.不同提取pH条件下火麻仁蛋白组分的功能性质研究[J].2014，30（2）：16-19.

[8]钟玲，尹蓉莉，张仲林.超声提取技术在中药提取中的研究进展[J].西南军医，2007，9（6）84-87.

（收稿日期：2015.12.20）