地中海贫血实验诊断的研究进展

●陆敏丽

地中海贫血实验诊断的研究进展

●陆敏丽

贫血是现代人所面临的主要血液疾病之一，其中地中海贫血症在我国的发病几率较高，目前仍无针对性的治愈模式，但早发现早治疗仍然可以最大限度地保证患者的生命健康。本文即是对地中海贫血症的实验诊断技术进展进行研究，首先介绍了地中海贫血的概念，并对筛查法和基因诊断两种实验诊断技术的进展进行阐述，以期能为相关工作提供参考。

地中海贫血；实验诊断；技术进展

基因是决定生物体生理功能的重要因素，也是一切生物进化的基础，一旦基因发生改变就会影响生物体的功能和生存状态，其中绝大多数的基因改变均会给生物体造成负面影响，并且会遗传给后代。地中海贫血症是典型的遗传性疾病之一，也是溶血性贫血症的一种，给人体带来的危害性极强，如果未开展及时的诊断和治疗，可能会导致患者死亡，而实验诊断是目前针对地中海贫血症准确率较高的诊断技术。

1 地中海贫血症的概述

地中海贫血症最早在1925年发现，由于发现地点位于地中海地区，因此而命名，目前其在我国贫血症中的发生率也较高，尤其是在广东、广西、四川等南方地区。该疾病是由于人体常染色体存在遗传性的缺陷，导致细胞内珠蛋白链无法正常合成，表现为单一或多种珠蛋白缺乏，使得血红细胞更容易被血浆所溶解，因此地中海贫血症也属于溶血性贫血的一种。在健康人群的血红细胞当中，合成珠蛋白需依靠4条肽链，分别是α、β、γ、δ，其分别由细胞内相应的基因编码合成，如果编码基因缺失或突变，就导致了蛋白质肽链无法合成，珠蛋白结构发生改变，也就无法发挥其原有的功能，由此也可将地中海贫血症分为四个种类，其中发病率最高的为β型地中海贫血症[1]。患病者的临床表现为肝脾肿大、血红细胞计数异常下降、黄疸、发育不良、眼距增大、前额突出等，而且其骨骼造血功能异常活跃，使得骨髓腔直径增加，骨质厚度相对降低，易引发长骨骨折性病变，少数患者还会出现胆囊结石、下肢溃疡或心包炎等病变，大多数患者均可生活到成年，但病情严重的新生儿在出生后不久就会死亡，因此及早的诊断能够为患者赢得更多的治疗时间[2]。

2 地中海贫血症的筛查实验诊断研究进展

虽然目前对于重症地中海贫血的治愈仍存在问题，但随着医疗技术的不断进步，越来越多的患者病情得到了缓解，而这也要归功于及时准确的实验诊断技术。其中筛查实验技术不仅操作简单，而且诊断费用更低，可应用于婚检的男女双方、孕前和产前检查的夫妇双方当中，达到预防地中海贫血患儿出生的优生目的。根据筛查对象的不同可分为两种方式，分别是血液常规检查、血红蛋白检查，具体如下：

2.1 血液常规实验诊断进展

血常规实验诊断是临床诊断中较为常用的技术之一，也是地中海贫血症筛查中必须开展的一项检查，其中以血细胞计数诊断为主，利用计数仪可对脐带血中血红细胞、白细胞等的数量和形态进行检查，其中血红细胞数量减少、体积降低（平均体积低于79FL）、血红蛋白含量下降（平均含量低于27pg）是怀疑为地中海贫血症的主要依据[3]。

同时对红细胞膜渗透脆性的实验检查也是诊断依据之一，其主要是利用不同渗透压浓度下红细胞膜对于外界物质渗透的抵抗能力进行测试，也就是对血红细胞发生溶解的临界值进行诊断，该临界值也代表了血红细胞表面积与体积之间的比例。如血红细胞膜的渗透脆性较低，则说明细胞膜对于外界渗透压的抵抗能力较低，容易导致外界物质大量进入细胞内，使得细胞体积膨胀而发生破裂，引发溶血性贫血病变。根据现代研究证明地中海贫血患者血红细胞存在不同程度的形变和渗透脆性的减弱情况，因此该实验诊断具有科学依据和数据支持[4]。

2.2 血红蛋白实验诊断进展

根据现代医学研究显示，地中海贫血症患者血液中血红蛋白存在明显的不稳定性，这主要是由于珠蛋白合成障碍使得血红蛋白本身结构发生改变，从而导致了性质的不稳，在实验诊断当中可利用异丙醇沉淀法，即将实验温度控制在37℃下，异丙醇溶液浓度控制在17%，此时将患者血红蛋白样本加入其中，如5min后出现沉淀、20min后出现絮状物质，则说明样本中存在不稳定的血红蛋白，可怀疑该患者具有地中海贫血症

[5]。

同时还可以根据包涵体生成量测定法进行诊断，其利用了不稳定血红蛋白和煌焦油蓝等试剂反应后产生的特殊包涵体为依据，在温度为37℃的环境下进行恒温孵化，如2h内出现了数量较多的包涵体（以α型地中海贫血症最多），则说明患者具有地中海贫血症，该实验诊断方法操作简单，但相比于异丙醇沉淀法所需要的检测时间更长。

还可以利用血红蛋白电泳诊断技术，因为人体内所有的血红蛋白的等电点均在7以下，在pH=8.5的盐环境当中带有大量的负电荷，如果此时环境中具有一个电场的作用力，则血红蛋白就会以不同的速度相阳极移动，通过其移动速度就可以判断血红蛋白的稳定性。加之利用醋酸纤维薄膜，可定量地分析不稳定血红蛋白，确定地中海贫血症的发病程度。根据实验当中所使用的电泳介质不同可分为毛细管、Hb琼脂糖等，该实验诊断技术具有操作简便、灵敏度高、准确率高、样本消耗量低等诸多特征，在孕妇妊娠期检测中应用范围较广，其中Hb琼脂糖诊断可借助全自动检测仪完成，使得诊断时间进一步缩减，并且定量定性检测更加准确，所获得的电泳图谱可永久性保存，但在实际应用时会出现假阴性的情况，因此如患者异丙醇沉淀呈阳性，则需要结合醋酸纤维薄膜检测结果进行综合分析。

3 地中海贫血的基因实验诊断研究进展

地中海贫血症本身是由于常染色体内基因变异或缺失所引发的病症，因此利用基因实验诊断技术能够更加准确地判断患者的病症。我国最早利用基因实验诊断地中海贫血症的技术为DNA点杂交技术，后随着医疗技术的进步又发展出了限制性内切酶谱系诊断技术、寡核苷酸探针杂交、聚合链酶反应体外扩增、芯片技术等，其中聚合链酶反应技术目前国内应用范围更大。

3.1 限制性内切酶谱系诊断技术

根据生物体DNA的特点，利用限制性内切酶可以有效地识别和切割DNA上特定的序列，从而获得长度已定的片段，但是如果DNA的碱基发生变异，就会导致其上内切位点丧失，使得限制性内切酶切割后的DNA片段长度发生变化，从而确定人体内是否存在变异的基因序列。这种实验诊断技术的准确性非常高，基本不存在假阴性的情况，但其无法诊断被检测对象基因突变的具体情况，而且对操作人员技术的要求较高，即使明确了检测对象存在基因突变的病症，但无法确诊为地中海贫血症，因此可将其作为准确辅助诊断数据之一[6]。

3.2 探针斑点杂交技术

该诊断技术主要依据DNA序列互补原则，以引物来扩增诊断对象珠蛋白的基因链，并合成与突变序列相互互补的DNA序列，利用尼龙膜作为载体，分别就正常基因和变异基因的杂交探针进行对比标记，如杂交探针不完全与正常基因互补，则可以在一定条件下进行洗脱，可直接利用发射自显影技术对实验诊断结果进行观察。该项诊断技术的优势在于操作时间更短，且诊断结果的灵敏性更高，但其对于目标DNA的准确性和纯度要求也较高，因为一旦所选择的突变DNA错误，就会导致合成的互补链错误，实验结果无任何意义，目前我国将其主要应用在β型地中海贫血症诊断当中。

3.3 聚合链酶反应诊断技术

我国所应用的地中海贫血基因诊断技术中聚合链酶反应技术的范围最大，其可以在体外环境下开展扩增实验，从而降低了对DNA片段选择的难度，根据所使用的聚合链酶反应技术不同可分为多种形式。多重聚合链酶反应技术是其中之一，该技术下包含了四对等位基因的引物，根据每对等位基因引物突变为点的特异性扩增来判断患者的患病情况，可利用其对α型SEA缺失、3.7缺失（右缺失）以及4.2缺失（左缺失）进行鉴别。

同时可利用缺口性聚合链酶反应技术，在诊断时需设计2或3对引物，在靠近基因缺失位点的外侧设计1对引物，内侧设计1对或2对引物。其中在缺失位点内侧的引物能够诱导缺失DNA或正常DNA扩增出相应片段，但前提是该诊断DNA内纯合子不能缺失，此时在缺失位点外侧的1对引物就会使缺失的两端不断扩增拉近，从而检测出诊断DNA中的纯合子情况。目前，我国临床应用该项技术能够分辨出3种地中海贫血症[7]。

荧光聚合链酶反应技术的诊断敏感性更高，其是常规技术的1000倍左右，而且还可以利用不同的荧光素对体外扩增的DNA片段进行标记，从而使诊断者更容易分辨正常的DNA片段、杂合子以及纯合子。目前我国高等医疗机构内已经配备了相关扫描仪器，主要针对常见的β型地中海贫血症实验诊断，其操作更加简单，且对DNA提取量要求较高低，诊断时间更短，但相对应的成本较高[8]。

3.4 反向点杂交诊断技术

该杂交技术的基本理念与探针点杂交相似，但反向点杂交技术是将固定的靶向DNA更换为固定的探针，可通过单一杂交分别诊断DNA上多个变异位点，提升了临床诊断的效率。在诊断过程中以DNA末端的转移酶为目标，使其转变为多聚尾巴，并将其固定在制定的生物膜上进行序列扩增杂交，杂交完成后可利用电泳法对基因片段进行确定，包括不同类型的纯合子、杂合子等的诊断，目前广泛地应用在突变型β型地中海贫血症、缺失型α型地中海贫血症的诊断当中。

3.5 基因芯片杂交诊断技术

随着当前国内对地中海贫血症研究的不断深入，使得该类疾病突变型患者的诊断技术得到了较大的发展，其中基因芯片技术的科技含量较高。该技术本身也属于DNA杂交技术的一种，其以基因序列核苷酸的扩增技术为实验基础，以荧光素标记或引物检测等为方式，判断发生突变基因的情况。其中荧光标记法中不同突变位点所表现出的荧光颜色深浅具有一定差异，因此可根据其标记后颜色的变化来判断贫血症的具体类型，这样的诊断技术更加直接、快速、有效。同时，由于基因芯片本身的通量较高，使得多个待测DNA样本可以在同一张芯片上进行诊断，这样有利于如我国这种人口数量较多的国家开展地中海贫血症的普查工作[9]。但也由于该项诊断的技术含量较高，基因芯片的成本居高不下，临床诊断成本是普通人难以接受的，在我国目前也仅适用于地区人口疾病普查工作当中，限制了该技术的应用范围。

3.6 Southern印记杂交

该技术是对检查的DNA片段杂交情况进行鉴别，即利用靶向DNA作为模板形成杂交DNA片段，并将其以电泳的方式进行分离，再结合在固相支持物上利用探针进行鉴别的技术。该技术与其它DNA杂交技术一样，均能够对检测基因中存在的问题进行鉴别，但该技术主要应用在基因缺失型地中海贫血症，以α型缺失型病症为主，目前已经成为了该类疾病实验室诊断中所的“金标准”[10]。

4 结语

随着国际上医疗技术发展速度的加快，对于地中海贫血症的实验诊断技术也在不断提升，血液筛查和基因诊断方式层出不穷。但由于目前我国各地区贫富差距仍较为明显，使得各基层医院内并没有充足的条件来开展产前检查工作，使得地中海贫血症的诊断率下降。而导致这一情况的原因在于检查费用过高、操作步骤繁琐等，因此在未来地中海贫血症实验诊断技术发展时，应向着更加快捷、简便、低廉等方向。

（作者单位：广西平南县妇幼保健院检验科）

[1]李旭艳.联合检测在地中海贫血实验诊断中的应用[J].现代诊断与治疗，2014（09）：2078-2079.

[2]刘贵建，孙士鹏.地中海贫血的实验诊断:项目和方法的选择及临床应用评价[J].中华检验医学杂志，2012，35（05）：385-389.

[3]黄金文，黄瑞洪.540例地中海贫血初筛试验阳性患者基因诊断结果分析[J].中国实验诊断学，2014（11）：1871-1872.

[4]刘铁牛，黄强，陈要朋，等.地中海贫血患者尿液电导率的变化分析[J].中国实验诊断学，2012，16（08）：1477-1478.

[5]张巧玲，杨永强.地中海贫血筛查试验在小红细胞低色素性贫血病因鉴别诊断中的应用[J].中国实验诊断学，2014（08）：1333-1337.

[6]杨金玲，郑敏.β地中海贫血实验室诊断的研究进展[J].中国优生与遗传杂志，2016（04）：7-8.

[7]刘宜平，冯建军，尹维，等.地中海贫血诊断方法研究进展[J].川北医学院学报，2016，31（04）：622-625.

[8]陈暖，彭学宏，张俏忻，等.PCR结合反向点杂交技术在β-地中海贫血基因诊断中的应用评价[J].中国校医，2015，29（05）：351-352.

[9]陈永秀.地中海贫血实验室诊断技术进展[J].实验与检验医学，2012，30（03）：256-258.

[10]毛良英，曾春霞.地中海贫血实验室筛查和诊断方法进展与评价[J].检验医学与临床，2014（s2）：313-315.