现代分子生物学技术在食品和药品微生物检测中的应用

2016-03-27陈燕银华测检测认证集团股份有限公司

食品安全导刊 2016年15期

□ 陈燕银华测检测认证集团股份有限公司

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在我国药品、食品行业急速发展的社会形势下，食品、药品的质量与人们生命健康息息相关，然而我国当前使用的食品、药品检测手段还不够先进，因此，发展一项新的食品、药品检测技术具有现实性。本文首先详细分析了聚合酶链式反应技术的原理、应用及前景，接着简要介绍了变性梯度凝胶电泳技术、基因芯片和现代免疫技术。

现代分子生物学技术主要由聚合酶链式反应技术、变性梯度凝胶电泳技术、基因芯片技术及现代免疫技术组成，这些技术随着生物学家们对DNA分子双螺旋结构的探索及对基因和染色体的研究逐渐发展而成熟，克服了传统食品、药品检测技术灵敏性差、成本高等缺点，从而在食品和药品检测等方面的应用逐渐增加。

现代各项分子生物学技术

聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术（PCR）实质上可以视为DNA的体外复制。这项技术可以将微量的DNA进行大量扩增，然后根据其基因和染色体确定该微生物的基因型，因此，被广泛用于食品及药品等微生物检测领域。聚合酶链式反应技术的基本原理是在体外高速扩增特定DNA分子片段。在高温等外界条件满足的情况下，先解旋双链DNA，使它变成单链，然后再稍微降低温度，在DNA聚合酶的作用下与引物进行互补配对，形成新的DNA双链结构。合成的新双链结构又可以继续作为扩增时的模板，再给予合适的温度环境，按照上述步骤可以进行无限扩增。该项技术的重点是对温度严格控制。虽然用PCR技术检测食品和药品中致病微生物的方法与传统方法相比有灵敏度高、特异性强、时间短等优点，但它同样有许多问题。PCR所需要的合成引物需要极高的技术，这种技术很难推广。由于PCR技术的高灵敏性，常会出现误把微量外源污染的DNA当作有害微生物的情况，会造成假阳性后果。而且PCR技术对温度有较高要求，一旦外界环境不适宜，或者DNA序列选取不合适，就可能会使引物突变或灵敏度降低。荧光PCR技术虽然能解决准确度不高和假阳性问题，但该技术价格昂贵，难以普及。因此，如何使PCR技术和其他技术相结合，取长补短，是未来食品和药品检测的发展方向。

变性梯度凝胶电泳技术

该技术的基本原理是DNA在浓度不一样的变性剂中连接程度会不同，从而会产生不一样的电泳迁移率，根据电泳迁移率的不同，可以分离碱基组成不一致的DNA片段。这项技术可以与DNA测序技术联合使用，来分析食品与药品的菌落组成成分。变性梯度凝胶电泳技术能探究微生物种群的多样性和动态活性，使人类研究自然生物群落有了新的方向，然而这项技术还是存在着局限性，它还不能对微生物的数目及代谢活性进行检测。

基因芯片技术

基因芯片技术的基本原理是与已知序列、固定标记了的DNA探针进行杂交，然后再进行核苷酸测序，从而对样品进行检测和分析。这项技术集化学、物理、计算机学科于一体，是一项高度交叉的新型技术，目前被广泛应用于筛选检测药物、寻找新基因、检测微生物以及临床诊断。该技术具有多样性、并行性、自动性和微型化，并且可以同时在同一片芯片上检测出众多种类的生物分子。虽然至今为止基因芯片技术还没有被用于食品、药品检测，但其在检测蛋白质和分析基因表达等方面成效显著。

现代免疫技术

作为食品、药品卫生检测的主要方法之一，免疫技术以其价格低廉、操作方便、实用性强的优点已在食品、药品检测中普遍使用。李斯特氏菌、沙门氏菌及大肠杆菌等常见的具有污染性的病原菌都能使用现代免疫技术检测。目前，高速发展的免疫学新型技术与传统技术相比，增加了放射免疫测试、荧光免疫测试、酶免疫测试、免疫磁性分离及免疫传感器测试等技术。

各项现代分子技术的应用

聚合酶链式反应技术在食品、药品检测中的应用

1 聚合酶链式反应技术在转基因食品检测中的应用

现代基因技术的发展使得人们日常生活中出现了各种各样的转基因食品，这些转基因食品大多含有新的蛋白质和DNA，因此，转基因食品的安全需要进行专业检验才能使消费者放心大胆购买。主流的转基因食品检验方法有PCR检测法、蛋白质检测法、蛋白酶活性检测法。在这些方法中聚合酶链式反应技术是最安全有效的，因为其具有不同于其他两种方法的优点，蛋白质和酶主要成分都是蛋白质，而蛋白质易变性失活，不适用于专业检验。Q- PCR技术是一种敏感度高、特异性强、灵活度高的技术，能检测出超低含量的转基因成分。荧光定量技术是另一种新型PCR技术，该技术加入了一种荧光基因，这种荧光信号会被应用于整个PCR检测过程，成功解决了以往PCR检测方法中存在的准确度低和假阳性问题。

2 聚合酶链式反应技术在致病食品微生物检测中的应用

食品致病微生物主要有单核细胞增生性李斯特氏菌、肉毒梭菌、沙门氏菌和弧菌等，PCR技术检测这类致病微生物时，具有迅速、敏感等特性，是传统方法无法做到的。单核细胞增生性李斯特氏菌是牛奶等食品中主要的病原菌，用裂解法提取食品中的DNA，再用半套式PCR技术检测，特殊合成的引物可对其进行特异性扩增，而且不会对其他菌类产生反应。这种半套式PCR技术检测限度在10个UFC以下，敏感性比传统PCR技术高，检测时间也比传统方法短，仅需五六个小时。肉毒梭菌最易使肉类致病，传统方法提取肉毒梭菌需要很多天，而选择检测肉毒神经霉素的基因序列，合成特定的引物用来同时复制A、B、E、F型毒素的基因，虽然该种方法可以加快检测速度，但是PCR只能用来检测肉毒梭菌是否存在，而无法判断有菌无毒或霉素与菌并存的状态，因此，PCR对肉毒梭菌的检测只能作为参考。副溶血弧菌主要分布于盐湖及海洋微生物区，常见于水产品中，用PCR技术对其进行检测，比传统方法更便捷、灵敏、迅速，而且具有高准确性和可靠性。沙门氏菌是动物体内的一种肠道菌，它是导致人们食物中毒的罪魁祸首之一。基本上所有沙门氏菌都有与入侵相关的DNA，所以PCR技术检测沙门氏菌具有超高灵敏度。

3 聚合酶链式反应技术在药品检测中的应用

药品中主要用到的是PCR的实时荧光技术，该技术可以比传统技术更迅速、更准确地检测到药品中有害的金黄色葡萄球菌等。

变性梯度凝胶电泳技术在微生物检测中的应用

变性梯度凝胶技术主要应用于检测食源性致病菌和菌落变化。构建与优化聚合酶链式反应和变性梯度凝胶技术，再结合DNA测序技术，能分析出不同地区川芎内含真菌的差异性，这样就能得出川芎种群系统结构的多样性以及环境对川芎的各方面影响。

现代免疫技术在食品、药品检测中的应用

免疫吸附技术可以测定乳制品中的lgG含量。分离食品中的李斯特氏菌可以进行免疫磁性分离，再与聚合酶链式反应相结合，建立一种新的酶链式反应法。这种方法能排除聚合酶链式反应中杂菌、食品基质、培养基组成成分等因素干扰，且具有迅速、准确、敏感性强的优点，成功解决了两种方法单独使用时会出现的问题。除此之外，现代免疫技术也可用抗原-抗体反应检测赤潮霉素中毒素的类型和含量。