RNA干扰技术在育种方面的应用

魏　强　王　莉　崔林虎

（吉林省通化市种子管理站，通化134000）

RNA干扰技术在育种方面的应用

魏强王莉崔林虎

（吉林省通化市种子管理站，通化134000）

RNA干扰（RNAi，RNA inference）即双链微小RNA片段能使其同源的mRNA发生特异性降解，从而实现基因转录后沉默的手段［1］，这种模式广泛存在于动物、植物和真菌中。这种新兴的RNA干扰技术是分子水平的转基因育种重要手段之一，具有育种年限短、定向改良品种等多项优势。本文概述了RNAi的研究历史，对RNA介导的转基因沉默的机制、特点和实施方法等进行了概括，并对其在农业方面的应用进行了阐述。

RNAi；转基因育种；基因沉默

面临着日益增长的人口，耕地面积不断减少的今天，粮食问题成为解决生计的重要课题之一，不断地培育出优良新品种是解决粮食问题的重要手段之一。然而传统育种有着育种周期长、种质资源有限、占用过多的人力、物力等弊端，而转基因育种是当前最为快捷的育种方式，育种周期短、特异性强。RNAi技术在过去的10年中得到广泛的研究，是当今最热门的研究项目之一。RNAi技术的出现给转基因育种提供了新的手段和方法，能够特异性的繁育品种，在转录后水平上特异性地控制某个性状表达，从而起到改良品种的作用。RNAi技术已在马铃薯、水稻、小麦等作物中得到成功应用。

1　RNAi技术的研究发现

20世纪90年代初，N．Romano等［2］通过增加基因拷贝数来增强矮牵牛花紫色色素的表达，不仅没有达到预期开紫花的效果，反而部分或全部开白颜色花，由此推断其色素合成的机制被干扰或者关闭，他们将这一机制定义为共抑制。C．Cogoni等［3］1994年发现外源类胡萝卜素基因导入链孢霉中，其内源的类胡萝卜素表达量下降，他们将这种现象称为消除作用。1995年S.Guo等［4］在利用反义干扰技术探究线虫的基因功能时，发现无论是正义片段还是反义片段均能阻碍靶向Par-1基因的表达。1998年A.Fire等［5］发现正义片段能起到干扰作用是因为混入了反义片段，并首次将靶向Par-1基因正、反义片段同时转入线虫卵中，发现其干扰抑制作用比单独反义片段强100倍，并由此提出RNAi的概念，从此掀起RNAi技术研究热潮。随着不断的探索，果蝇、拟南芥、小鼠等均存在这种干扰抑制现象，并且普遍在动物、植物和真菌中均有体现。随着RNAi技术的不断研究，人们开始逐渐意识到RNAi技术在功能基因组的开发研究、药物研发、动植物育种等方面的研究上有着尤为重要的意义。

2　RNAi的作用机制

这些年来，对RNAi的干扰机制有很多研究，最有说服力的研究是基因转录后沉默效应。在多种酶的共同参与下，转录后的信使RNA（mRNA）被特异性地切成小片段，从而达到转录后基因沉默的效果。

2.1启动阶段起始过程是进入细胞的dsRNA（doublestranded RNA）被Dicer酶识别并特异性地切割成21～25个核苷酸片段（nt）的siRNA（small interfering RNA）。后者与其结合的靶向mRNA的序列具有同源性，siRNA的2个单链为21～23nt的小片断，其中位于最后的5′末端为磷酸基，3′末端为羟基并带有2个突出的核苷酸。此结构说明siRNA是通过RNaseIII剪切长dsRNA所产生，且具有RNaseIII剪切反应的所有特征。

2.2效应阶段细胞中含有一种由解旋酶、核酸内切酶、外切酶等构成的蛋白复合物，是效应阶段的主要参与物质，siRNA在解旋酶的作用下将双链打开，并形成单独的正义片段和反义片段，其中反义片段与蛋白复合物相结合，E.Bernstein等［6］将此复合物命名为RNA诱导的沉默复合物（RISC，RNA induced silencing complex）。活化后的RISC能够特异性识别mRNA，通过碱基互补配对与其结合，而后在核酸内切酶的作用下特异性地将mRNA切割成12～23nt的小片段，达到转录后抑制靶基因表达。

2.3扩增阶段21世纪初，C.Lipardi等［7］对果蝇胚胎进行提取，研究发现siRNA不仅可以抑制靶基因表达，还可以作为引物，以mRNA为模板，由RNA聚合酶（RdRP，RNA dependent RNA polymerase）进行催化，产生更多的dsRNA，而这些dsRNA能被完全切成siRNA，完成一次扩增循环，通过这样的扩增机制能使得RNAi效应逐渐被放大，因此只要少量的dsRNA就能完成RNAi作用。

3　RNAi的作用特点

3.1高特异性研究发现siRNA进行序列识别时只有正义链3′端的2个碱基不起主要作用，位于siRNA序列中的其他碱基只要有1nt的碱基发生突变，其对基因的抑制作用就会消失，因此RNAi可以靶向定位mRNA使其相应基因表达沉默，对于非特异性基因不发生反应。

3.2高效性注入细胞内的少量dsRNA会通过扩增阶段获得大量的dsRNA，由此产生更强的作用。

3.3RNAi的选择性外源性dsRNA只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响。

3.4RNAi的时效性研究发现RNAi在较为低等生物中可以持续作用，但是在哺乳动物的细胞中却只能作用较短时间，并且它的作用强弱与dsRNA的起始含量有关，不断地注入dsRNA才能产生持续沉默效应。

3.5可传播性和可遗传性细胞壁和细胞膜无法阻碍RNAi的作用机制，能够在细胞与细胞之间进行传递，不受细胞束缚。在线虫中，这种干涉效应仅仅可以遗传给子1代，往后会变成野生型。

4　作物中RNAi的诱导方法

RNAi的诱导方法有多种，例如农杆菌转化法、稳定转化法、高速粒子炮轰法、病毒介导转化法（VIGS）等，这些方法是植物诱导常用方法。农杆菌转化介导法具有操作简单、快捷、廉价等优点，通常使用根瘤农杆菌介导dsRNA转化到植物细胞中。稳定转化法包括电击穿孔法、聚乙二醇介导法等，它适用于多种作物和植物，其缺点是转化时间长，不适于基因功能的大量鉴定。高速粒子炮轰法转化周期短但是转化效率底。病毒介导法将携带dsRNA的病毒侵入植物宿主细胞内，通过病毒的复制来扩增和扩散dsRNA，从而来介导转录后的基因沉默。

5　RNAi技术在育种方面的应用

传统育种通常采用杂交、回交等育种方法，不仅受到种质资源的限制，并且育种周期长，改良效果有限。RNAi技术弥补了传统育种上的不足，不仅可以缩短育种年限，而且能够定向改良作物品质。

5.1在测定基因功能方面RNAi技术为水稻和拟南芥的基因功能测定提供了高效、快捷的途径。D.Miki等［8］利用RNAi工具分析保守型作物多基因家族。李小平等［9］应用RNA干扰技术证明了rlpk2基因是大豆中调控衰老的相关基因。H.Kumagai等［10］在应用RNA干扰技术对FNOD40基因的研究中发现FNOD40基

因关系到根瘤的生成和生长。

5.2在植物抗病性方面通过将水稻黄斑病毒（RYMV）复制所必须的酶基因导入水稻，利用RNAi机制培育出具有RYMV抗性的水稻［11］。赵明敏等［12］应用RNAi技术成功抑制烟草花叶病毒（TMV，Tobscco mosaic virus）表达。

5.3在改良作物营养价值方面的应用万群［13］将番茄红素的环化酶基因siRNA干扰序列转化入番茄中，得到的番茄红素是普通的2.1倍。柴晓杰等［14］采用RNAi方法使得玉米支链淀粉含量下降。马建［15］应用RNAi手段使得大豆脂肪氧化酶的表达量下降了。Q.Liu等［16］利用RNAi技术，以棉花子粒中2种关键酶的基因为模板，设计外源dsRNA导入棉花子粒，使目标基因发生沉默效应，使油酸在棉花子油中的比例提高到77%，硬脂酸比例提高至40%，获得了2种酸含量较高的转化植株，并最终杂交获得了高油酸和高硬脂酸的棉花植株，成功对棉花子油的成分实施改良。

6　结束语

近10多年来RNAi技术的兴起应用到各行各业中，为农业育种、药物研发、功能基因组的鉴定等提供了有力的工具，尤其是其特异性强、效率高等优良特性在农业育种方面得到了广泛的应用，弥补了传统育种上由于种质资源有限和育种年限长给农业育种方面带来的困扰。通过RNAi技术能够在明确基因功能的基础上定向改良品种，节省了大量的人力、物力和财力。随着对RNAi技术认识和研究的不断加深，会在各个领域给人们带来新的福利。

［1］廖银花，贺修胜．RNA干扰研究进展．现代生物医学进展，2007，7（5）：773-776

［2］Romano N，Macino G．Quelling：transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences．Mol Microbiol，1992，6：3343-3353

［3］Cogoni C，Romano N，Macino G．Suppression of gene expression by homologous transgenes．Antonie Van Leeuwenhoek，1994，65（3）：205-209

［4］Guo S，Kemphues K J．Par-1，a gene required for establishing polarity in C．elegans embryos，encodes a putative Ser／Thr kinase that is asymmerrically distributed．Cell，1995，81（4）：611-620

［5］Fire A，Xu S，Montqomery M K，et al．Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans．Nature，1998，391（6669）：744-745

［6］Bernstein E，Caudy A A，Hammond S M，et al．Role for a bidentate ribonucleaseinthe initiation step of RNA interference．Nature，2001，409（6818）：363-366

［7］Lipardi C，Wei Q，Paterson B M，et al．RNAi as random degradative PCR：siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs．Cell，2001，107（3）：297-307

［8］Miki D，Itoh R，Shimamoto K．RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice．Plant Physiol，2005，138：1903-1913

［9］李小平，马媛媛，李鹏丽，等．利用RNA干扰敲减rlpk2基因的表达可以延缓大豆叶片衰老．科学通报，2005，11（50）：1090-1096

［10］Kumagai H，Kinoshita E，Ridge R W，et al．RNAi knock- down of ENOD40s leads to significant suppression of nodule Formation in Lotus japonicus．Plant Cell Physiol，2006，47（8）：1102-1111

［11］Pinto Y M，Kok R A，Bandcombe D C．Resistance to rice yellow mottle virus（RYMV ）in cultivated African rice varieties containing RYMV transgenes．Nat Biotechnol，1999，17：702-707

［12］赵明敏，安德荣，黄广华，等．瞬时表达靶向TMV外壳蛋白基因的siRNA能干扰病毒侵染．植物病理学报，2006，36（1）：35-40

［13］万群．RNAi介导的LCY基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响．重庆：西南大学，2007

［14］柴晓杰，王丕武，关淑艳，等．应用RNA干扰技术降低玉米支链淀粉含量．植物生理与分子生物学学报，2005，31（6）：625-630

［15］马建．大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究．吉林：吉林农业大学，2008

［16］Liu Q，Singh S P，Green A G．High-stearic and High-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing．Plant Physiol，2002，129（4）：1732-1743

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