参苓白术散含药血清影响A549/DDP的顺铂耐药的研究

●史妍婷 丁福荣 陈芳 程海清 刘永

参苓白术散含药血清影响A549/DDP的顺铂耐药的研究

●史妍婷 丁福荣 陈芳 程海清 刘永

目的：研究参苓白术散含药血清对肺腺癌顺铂细胞株(A549/DDP)顺铂耐药的影响。方法：动物随机分组，制备参苓白术散大中小剂量血清(给药剂量分别为11.34，5.67，2.83g·kg-1·d-1)，将A549,A549/DDP细胞体外分为顺铂(DDP)组，空白血清+DDP组，含药血清大剂量+DDP组，含药血清中剂量+DDP组，含药血清小剂量+DDP组，细胞对照组，经过15%各组血清联合DDP不同浓度(10，20，40，80，100，200 µmol·L-1)作用48 h,采用MTT法检测参苓白术散不同浓度含药血清对A549/DDP顺铂耐药的作用；结果:与DDP组比较,参苓白术散不同浓度含药血清作用于A549/DDP后IC50和耐药倍数均有显著降低(P＜0.05)，以中剂量组(等临床剂量组)作用最为显著(P＜0．01)。结论:参苓白术散能增强A549/DDP对顺铂的敏感性。

参苓白术散；肿瘤；A549/DDP

肺癌的发病率和死亡率高居恶性肿瘤的首位，对中晚期肺癌实施的以顺铂为主的联合化疗方案可显著延长患者的生存期。但由于顺铂耐药的发生，中晚期非小细胞肺癌经验性化疗疗效长期停滞于平台期[1，3]。因此寻找有效逆转肺癌顺铂耐药的药物是成功干预肺癌化疗的关键。前期研究成果表明，参苓白术散可通过提高患者的免疫能力，抗癌，消炎，保护受累组织等方面对中晚期肺癌起到综合性正性治疗作用[2]。为深入探讨其分子作用机制，我们运用血清药理学实验方法，体外研究参苓白术散对人肺腺癌细胞株(A549)顺铂耐药细胞系(A549/DDP)的影响.

1 材料

1.1 药品和试剂

参苓白术散药材购于济南协和大药房，经山东中医药大学中药鉴定教研室鉴定符合药典规定，将参苓白术散生药饮片浓缩成每毫升相当于原生药材1.134g的药液，冷却后装入灭菌药瓶，置4℃冰箱保存。顺铂(DDP)(齐鲁制药厂,批号WA1A1104003),DMEM高糖培养液(Hyclone，批号SH30022.01),胎牛血清(Hyclone，批号SV30087.02),MTT盐溶液(Genview,批号DH343-3)

1.2 动物

SD大鼠16只，许可证号SCXK（鲁）2015-0001，雌雄各半，体重(190-230)g，由山东中医药大学实验动物中心提供。

1.3 细胞株

A549/DDP,A549细胞株均购于中国医学院肿瘤研究中心，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，在37℃，5%C02条件下培养。

1.4 仪器设备

EL340i酶标仪(美国伯乐)，CKX41倒置显微镜(日本Olympus)，TCS-SP5激光共聚焦显微镜(德国莱卡)，Thermo CO2培养箱(美国)，

2 方法

2.1 含药血清的制备

动物按体重随机分为4组，A组为参苓白术散含药血清大剂量组(给药剂量11.34g·kg-1)，B组为参苓白术散含药血清中剂量组(给药剂量5.67g·kg-1，相当于临床等效剂量)，C组为参苓白术散含药血清小剂量组(给药剂量2.83g·kg-1)，D组为空白对照组(灌服相应体积的生理盐水)。每组每天ig给药1次，连续3 d给药，末次给药后禁食(12 h)，不禁水，再灌服1 d的量，1 h后，腹主动脉取血，无菌分离血清，经56℃，30min灭活处理后，用0.22µm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。

2.2 细胞培养

将复苏后的A549,A549/DDP细胞以1×106/mL接种于25mL培养瓶中，加入4mL含15%胎牛血清的DMEM培养基，置37℃，5%CO2培养箱培养。待细胞基本长满瓶壁后，用0．25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。实验时取对数生长期细胞。

2.3 MTT法检测含药血清联合顺铂对细胞增殖的抑制作用

取对数生长期细胞按每孔2×104个细胞接种于96孔培养板，37℃，5% CO2培养箱培养，24 h后分别加入受试物，继续培养48h，实验终止前4h加入MTT溶液(5mg·mL-1)20 µL,继续孵育4 h，除去每孔培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)200 µL，置摇床上振荡10min至结晶溶解，酶标仪以490 nm为测定波长，测每孔吸光度(A)值。实验设DDP组，含药血清大剂量+DDP组，含药血清中剂量+DDP组，含药血清小剂量+DDP组，空白血清+DDP组，细胞对照组和空白对照组，每组均设3个复孔。DDP分10，20，40，80，100，200 µmol·L-16个浓度级，细胞对照为不加药物的细胞悬液，空白对照为DMSO液。按改良寇式法计算半数抑制浓度（IC50）∶lgIC50=Xm-I [P-(3-Pm-Pn)/4](Xm∶lg最大剂量，I∶lg(最大剂量/相临剂量)，P∶阳性反应率之和，Pm∶最大阳性反应率，Pn∶最小阳性反应率)。按下式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=[1-(A药物处理组/A空白对照组)/(A细胞对照组/A空白对照组)]×100%，耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。

2.4 统计学方法

采用SPSS 17软件包进行One Way ANOVA方差分析，数据用±s表示， P＜0.05为差异有统计学意义,重复3次独立实验。

3 结果

参苓白术散含药血清对肺腺癌耐药细胞A549/DDP耐药性的影响：

每组药物处理48h后，参苓白术散含药血清大、中、小剂量与DDP均存在协同作用，IC50和耐药倍数均存在不同程度的降低，其中以中剂量组结果最为明显(P＜0．01)，提示参苓白术散含药血清可显著逆转肺腺癌耐药细胞株A549/DDP对DDP的耐药，但无明显改善DDP对A549的影响。

4 讨论

参苓白术散全方补气健脾，以治气虚之本，升举阳气，调理全身气机，为健脾益气之首选方。临床实践表明，肺癌患者化疗后常出现面色萎黄、恶心呕吐、食少消瘦、神疲乏力等脾胃虚弱，气血不足的表现，故改善肺癌耐药当以健脾益气为主[4,5]。

顺铂(DDP)是临床上常用的抗癌药物之一，具有较广的抗瘤谱。肺癌细胞对DDP产生耐药性，是化疗失败的主要原因之一。本实验研究结果显示，参苓白术散含药血清联合DDP在体外有明显的协同作用，可明显降低A549/DDP对DDP的耐药性，其中以参苓白术散等临床剂量含药血清(中剂量组)作用最为明显，等临床剂量组耐药倍数由6.51倍下降至1.93倍，说明肺腺癌耐药细胞经参苓白术散含药血清作用后发生了一系列生物学变化，使其对DDP的敏感性增强，具体作用机制还需进一步研究。

（作者单位：山东协和学院）

[1]郭其森.非小细胞肺癌内科治疗的现状[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(10):721.

[2]李瑞池.参苓白术散治疗晚期肺癌的体会[J].现代中西医结合杂志，2006,15(3):343.