HO-1蛋白介导艾灸预处理改善大鼠脑缺血再灌注损伤机制的初步研究

李秀坤，刘旭光，杨慎峭

(1.四川中医药高等专科学校，四川 绵阳 621000;2.成都中医药大学，成都 610075)

HO-1蛋白介导艾灸预处理改善大鼠脑缺血再灌注损伤机制的初步研究

李秀坤1，刘旭光2，杨慎峭2

(1.四川中医药高等专科学校，四川 绵阳 621000;2.成都中医药大学，成都 610075)

目的:观察艾灸预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及部分机制研究。方法:将实验按随机数字表法分为假手术组、脑缺血再灌注损伤组(MCAO组)、艾灸预处理每日1次组、艾灸预处理每日2次组4组，TTC染色及图像软件分析大鼠脑梗死体积，western-blot法检测脑组织中血红素氧合酶-1(HO-1)表达的变化。结果:MCAO组出现明显的神经功能缺失，各预处理组症状明显改善，且预处理组每日2次组优于每日1次组;假手术组脑组织均匀红色无梗死灶，MCAO组明显梗死苍白区;艾灸预处理较MCAO梗死体积均减小，且预处理每日2次组最为明显;MCAO组血浆CO浓度显著升高，各预处理组CO浓度降低，且每日2次组最显著;MCAO组HO-1蛋白表达均显著增加，各预处理组HO-1蛋白表达显著降低。结论:艾灸预处理能保护脑组织缺血再灌注损伤，其机制可能与通过下调HO-1蛋白表达，减少CO的合成和释放有关。

艾灸预处理;脑缺血再灌注;保护机制;CO;HO-1蛋白

脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指脑缺血一定时间再恢复血液供应后，大脑功能不仅没有得到及时恢复，反而出现更加严重的功能活动障碍［1］。Kitagawa等研究发现到缺血预处理 (ischemic preconditioning，IPC)对沙土鼠脑缺血具有保护作用［2］。近年来的实验发现，除缺血外其他多种预处理方式主要有缺氧、药物、高温、针刺预处理等。艾灸预处理(ischemic preconditioning，IP)能够诱导缺血耐受效应(ischemic tolerance，IT)，即一次或多次短暂缺血可以作为一种损伤性应激原，有效调动机体的内源性保护机制，产生保护作用［3］。HO-1为诱导性蛋白，正常生理情况下机体组织内的表达量很少，但在一些应激因素作用下可被大量诱导，如缺血、缺氧和炎症等［4］。本文拟通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，研究脑组织中细胞凋亡的过程，艾灸预处理对其的保护作用及脑组织中HO-1蛋白表达的变化，为临床治疗脑缺血再灌注损伤提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级 SD种大鼠8周龄，体质量180～220 g，雌雄不拘，室温下自由饮水饮食，实验开始前12 h禁食禁水。大鼠由成都中医药大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(川)2011-11)。

1.2 试剂

HO-1单克隆抗体(北京中杉);二抗为HRP标记兔多克隆(美国SANTA CRUZ);氯化-2，3，5-三苯基四氮唑，TTC(天津福晨);β-actin(博奥森);二氨基联苯胺(DAB)试剂盒，其余均为国产分析纯。

1.3 仪器

图像采集软件(德国 Lecia);数据分析系统(上海山富科学仪器有限公司);Biosens Digital Imaging System v1.6;电热恒温干燥箱(DHG-9031，上海);1/万电子天平(BS224S，德国);病理切片机(HM2235，德国);AUTO-CAD图像处理软件等;垂直电泳仪及转膜仪(北京六一)。线栓制备:鱼线直径 0.22 mm、长35 mm，完全浸泡在水合氯醛溶液中，消毒和软化鱼线，取出后脱脂棉擦拭1次、纯水冲洗2次自然风干。造模时浸泡在生理盐水中备用［5］。

1.4 方法

1.4.1 大鼠脑缺血模型制备 利用改良线栓法制备SD大鼠全脑缺血模型［5］，在室温下，1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于蜡板上剪毛、消毒，颈部正中部位纵行切开皮肤约2 cm长，钝性分离皮下组织，沿血管方向纵行钝性分离颈总动脉和颈外动脉;颈总动脉处置一根手术线不结扎，颈外动脉处置两根手术线，距分叉4 mm处结扎第1根手术线，在线结的远心端2 mm处结扎第2根手术线，于两线结之间高频电刀电凝夹闭血管，眼科剪剪断血管;分离颈外动脉第一分支枕动脉并电凝灼断血管，接着分离颈内动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉;于颈外动脉起始处置一手术线，打单结不收紧，紧靠残端线结处眼科剪垂直血管剪口;取出泡在生理盐水中的鱼线，从剪口处插进鱼线达颈内动脉夹闭处，松开颈内动脉的动脉夹，缓慢推进鱼线遇阻力时停止，结扎颈外动脉起始处的手术线，松开夹闭颈总动脉的动脉夹。记录缺血开始的时间，缺血90 min后缓慢拔出鱼线［6］，记录再灌注开始的时间。假手术组只分离颈总、颈外和颈内动脉，不插栓线［7］。

1.4.2 取穴与方法 根据《世界卫生组织标准针灸经穴定位(西太平洋地区)》［8］中的取穴方法，选择“百会”(顶骨正中)、“大椎”(第7颈椎与第1胸椎间，背部正中)、“足三里”(后三里，膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处)。艾灸方法:将艾条自制成直径约4 mm的细艾条，距穴位约2 cm左右悬起施灸，以动物安定为度，每穴灸15 min，每天1次，共灸7 d。

1.4.3 实验分组 将实验按随机数字表法分为假手术组、MCAO组、艾灸预处理每日1次组、艾灸预处理每日2次组4组各24只。假手术组仅暴露颈总、颈外和颈内动脉，不插栓线;MCAO组按1.4方法中行MCAO手术，2 h后行再灌注;艾灸预处理每日 1次组艾灸施灸 7 d后，对大鼠进形MCAO手术，2 h后行再灌注;艾灸预处理每日2次组每日2次艾灸，其余操作同艾灸预处理每日1次组。各组大鼠再灌注后24 h观察神经行为学评分。

1.4.4 神经行为学评分 依照 Longa等6分制神经学评分原则对大鼠行为进行评分。评分原则(大鼠清醒后1 h):0分:正常，无神经系统异常的体征;1分:不能完全伸展病变对侧前爪;2分:行走时向对侧旋转;3分:行走时向对侧倾倒;4分:不能自发行走，丧失意识;5分:意外死亡、再灌注24 h内死亡、蛛网膜下腔出血的大鼠被剔除［9］。1～4分者为成功模型。

1.4.5 TTC染色法检测脑梗死体积 大鼠缺血再灌注24 h后，每组随机选取存活的5只SD大鼠断头取脑，除去小脑和低位脑干、嗅球。将脑沿冠状面切成2 mm厚度，脑片置于质量分数为 l%的TTC溶液10 mL中，37℃避光孵育30 min。正常组织呈红色，梗死组织呈白色，数码相机正反面拍照，利用Image-pro 6.0分析脑片的梗死面积占脑片总面积的百分比［10］。

目前，昆明市全市总人口672.8万人，其中少数民族人口127.36万人，占全市总人口的18.9%，少数民族流动人口40万，占全市总人口的5.9%。呈现成份多、分布广、居住散，大多以经商、打工、招聘、婚姻等流动方式出现，他们大多不在城市长期居住，呈现出无定所、居住分散、流动性大、无组织、结构复杂等特点。

1.4.6 血浆 CO含量测定 联二亚硫酸盐还原法检测血浆中CO的浓度，将以上4组大鼠再灌注24 h以微吸管收集股静脉血10 μL，即刻放于已装满液体的试管内用封口膜封好，备测 CO浓度［11］。分别波长541 nm、555 nm处测吸光度，计算两者的比值，根据标准曲线计算出CO的量。

1.4.7 免疫印迹检测 HO-1蛋白的表达 取100 mg脑组织加入500 uL裂解液，4℃持续振摇30 min，离心5000 r/min×10 min后，吸取上清转入预冷的离心管，考马斯亮兰试剂测定组织中的蛋白浓度，样品加以上样缓冲液稀释后煮沸5 min使蛋白变性备用。灌制SDS-PAGE凝胶，取已制备好的组织蛋白，根据蛋白浓度检测结果计算每孔上样量后进行上样，在80 V电泳约90 min至溴酚蓝指示剂触凝胶底部，电泳后用100 mA电流将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜，滤膜经5%脱脂奶粉封闭过夜、剪膜，根据分子量分开后分别加入1∶500稀释的HO-1及内参抗体(β-actin 1∶3000)室温孵育3～4 h，TBST洗膜3次，以1∶2000稀释的HRP标记二抗孵育1 h后，再次洗膜3次，ECL发光液发光后X光片曝光，扫描记录结果，Gel-analyze分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，根据灰度比值计算蛋白的表达水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 脑梗死体积以及神经行为学评分

表1显示，假手术组表现无神经功能缺失，MCAO组及各治疗组均出现明显神经功能缺失，且各艾灸预处理组与MCAO组比较，神经行为学评分差异显著(P＜0.05);艾灸预处理每日1次组与艾灸预处理每日2次组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1图1显示，假手术组脑组织呈均匀红色无梗死灶，MCAO组和各艾灸预处理组可见梗死苍白区。与假手术组比较，MCAO组及艾灸预处理每日1次组、每日2次组均有明显的白色梗死灶，差异有统计学意义(P＜0.05);与 MCAO组比较，艾灸预处理每日1次组、艾灸预处理每日2次组梗死体积均减小，艾灸预处理每日2次组最为明显。

表1血浆中CO的浓度检测结果显示，大鼠脑缺血再灌注可使血浆CO浓度升高，与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，艾灸预处理每日1次组、每日2次组可使 CO浓度降低，且每日行灸2次血浆中 CO的浓度降低幅度最大(P＜0.01)。

表1 各组脑梗死体积、神经行为学以及血浆CO的变化(±s)

表1 各组脑梗死体积、神经行为学以及血浆CO的变化(±s)

注:与空白组比较:＊＊P＜0.01;与 MCAO组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 例数 Neurological scores Infarct volume(%) CO (μmol/L) 5 0 0 12.54±2.50 MCAO 组 5 3.4±1.03 33.52±3.73 20.33±4.16＊＊艾灸预处理每日1次组 5 2.3±0.86 24.14±4.38 17.26±3.24△艾灸预处理每日2次组 5 1.2±0.65 20.34±3.07 15.41±3.05假手术组△△

图1 TTC检测大鼠脑梗死体积

2.2 HO-1蛋白的表达

表2图2显示，与假手术组比较，MCAO组HO-1蛋白表达均显著增加(P＜0.01);与 MCAO组比较，艾灸预处理每日1次组、艾灸预处理每日2次组HO-1蛋白表达显著降低 (P＜0.05);与艾灸预处理每日1次组比较，艾灸预处理每日2次组 HO-1蛋白表达显著降低(P＜0.05)。

表2 各组HO-1蛋白的表达

图2 HO-1蛋白的表达

3 讨论

脑缺血是指脑血流量的减少或血流中断，再灌注是指脑缺血后血流减少区域的血流增加或产生血流的复通，同时会在某些情况下(如炎症反应)加重已缺血细胞、组织的进一步损伤［2］。近年来，对缺血性脑损害提出了预防性脑保护的概念，即预防性使用某些药物或措施后，能减轻缺血性脑损害的程度，改善预后，起到脑保护作用［12］。

随着人们预防观念的逐渐加强，未病先防成为人们研究的热点［13］。“治未病”一词最早来源于《黄帝内经》，是中医学里重要的防治思想。中医治未病的方法众多，或药、或针、或灸、或传统健身运动，因艾灸本身具有温热散寒、助元固本的功效，且操作简单、取材方便、价格相对低廉，因此艾灸常常被作为治未病的最佳方法，被临床广泛应用［14］。艾灸预处理即“逆灸”，属于逆针灸的一部分，即在机体健康无病、疾病发生之前或疾病发展轻浅之时，预先应用艾灸方法，激发经络之气，增强机体的抗病与应变能力，促进健康、保健延年、防止疾病的发生或疾病损害的传统方法，是针灸“治未病”的重要内容［15］。逆灸通过在疾病未显露之时或发病之初，运用针灸之法增强机体的抵抗力，迅速截断疾病的发展及传变，以达到预防疾病的目的，这种思想和现代医学所提出的“预处理”本质基本相同，就是通过预防性措施，最终将机体的损害降至最低，故逆灸是“治未病”的重要手段［13］。

本研究中，大鼠经MCAO造模后出现明显的神经功能缺失症状，艾灸预处理则能显著改善该症状，且预处理每日2次组较每日1次组缺失症状改善明显，充分说明艾灸预处理每日2次组能显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的神经功能缺失症状。进一步观察脑梗死体积研究发现，MCAO组可见大面积梗死苍白区，说明实验造模成功。艾灸预处理组的白色梗死灶体积显著减小，尤以预处理每日2次组最明显。由此可见，使用艾灸预处理不仅能改善脑缺血再灌注损伤造成的神经功能缺失症状，还能减少脑梗死灶体积，发挥保护作用，且每日行灸2次为最佳。

一氧化碳(carbon monoxide，CO)是重要的血管舒张因子和气体信使分子，具有促进损伤细胞的恢复、并能松弛血管平滑肌、阻止血小板聚集的作用，其在生物体内的作用方式与一氧化氮比较相似。研究表明，内源性的CO通过激活cGMP而起到脑保护作用［11］。血色素氧合酶(Heme oxygenase，HO)是合成CO的关键酶［16］，有三类形式同工酶即HO-1、HO-2、HO-3，其中以HO-1在体内的分布最为广泛。HO-1是目前已知最易受诱导的酶，能够接受各种应激刺激诱导其表达增强，如缺氧、ROS、细胞因子、NO、重金属离子等，HO-1/CO的表达调控作为一种防御机制在对抗氧化应激、炎症、缺血再灌注中均有重要作用［17］。本研究中，大鼠脑缺血再灌注血浆CO浓度升高，艾灸预处理可使CO浓度降低。MCAO组随着损伤程度加深，HO-1的蛋白表达量越高;艾灸预处理HO-1蛋白表达显著降低，每日2次组较每日1次显著降低，继而降低了CO的合成和释放，发挥脑保护作用，从而减轻脑缺血再灌注所造成的神经功能损伤，且艾灸预处理每日2次的保护作用最佳。由此可见，抑制HO-1的表达，减少CO的合成是艾灸预处理对大鼠脑缺血再灌注后脑保护作用机制之一。

未病先防，已病及时处理，防微杜渐，疾病初愈后将息调养，防其复发，经过历代医家的不断充实发展，逐步形成了内涵丰富、特色鲜明的“治未病”体系。本实验仅研究了脑组织中HO-1蛋白的表达对艾灸预处理大脑缺血再灌注损伤保护作用的机制研究，艾灸预处理如何实现其抗凋亡，值得进一步深入研究。

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Preliminary Study on Improving the Mechanism of Cerebral Ischemia Reperfusion Injury In Rats By Ho-1 Protein Mediated Moxibustion Preconditioning

LI Xiu-kun1，LIU Xu-guang2，YANG Shen-qiao2
(1.Sichuan College of Traditonal Chinese Medicine，Sichuan Mianyang 621000，China; 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Sichuan Chengdu 610075，China)

Objective:To observe the effects of moxibustion preconditioning on the protection effects and mechanisms on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.Methods:The experiment was divided into control group，sham operation group，ischemia reperfusion injury group(MCAO group)，Moxibustion preconditioning group 1 /d and moxibustion pretreatment of 2/d group，the infarct volume of rats in each group were analyzed by TTC staining and image software，and using Western-blot method to detect the changes of heme oxygenase the enzyme-1(HO-1)expression in brain tissues.Results:MCAO group showed significant loss of nerve function，The symptoms of each pretreatment group were significantly improved，And pretreatment of the 2/d group is better than the 1/d group;The brain tissue of sham operation group was evenly and without infarction，MCAO group was significantly infarct pale area;Moxibustion pretreatment decreased the infarct volume of MCAO，And pretreatment of the 2/d group is the most obvious;The plasma CO concentration of MCAO group was significantly increased，Reduction of CO concentration in each pretreatment group，And the 2/d group is the most obvious;The expression of HO-1 protein in MCAO group were significantly increased，The expression of HO-1 protein was significantly lower in each pretreatment group.Conclusion:Moxibustion preconditioning can protect cerebral ischemia reperfusion injury，The mechanism may be related to the down-regulation of HO-1 protein expression and reducing the synthesis and release of CO.

Moxibustion preconditioning;Cerebral ischemia reperfusion;Protection mechanism;HO-1 protein

R245.81

:B

:1006-3250(2016)07-0918-04

2016-01-15

李秀坤(1976-)，女，河北保定人，讲师，医学硕士，从事神经系统疾病针灸康复的临床与研究。