高海拔地区进展期胃癌切除修复交叉互补基因1 mRNA及蛋白表达与化疗疗效的相关性研究*

祁玉娟，韩静绮，才保加，骆玉霜，冀保妍，袁青玲，宋晓燕，张文彦，白丽艳，刘五甲（.青海省人民医院，青海西宁80007；.青海大学附属医院，青海西宁8000；.青海大学，青海西宁8006）



高海拔地区进展期胃癌切除修复交叉互补基因1 mRNA及蛋白表达与化疗疗效的相关性研究*

祁玉娟1，韩静绮2，才保加2，骆玉霜2，冀保妍1，袁青玲1，宋晓燕1，张文彦1，白丽艳3，刘五甲3
（1.青海省人民医院，青海西宁810007；2.青海大学附属医院，青海西宁810001；3.青海大学，青海西宁810016）

摘要：目的研究高海拔地区进展期胃癌切除修复交叉互补基因1（ERCC1）mRNA和蛋白表达，及其与化疗疗效的相关性。方法逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测60例进展期胃癌患者ERCC1 mRNA的表达，免疫组织化学法检测ERCC1蛋白的表达并予以FOLFOX4方案化疗，分析ERCC1 mRNA及蛋白表达与化疗客观反应率（ORR）和无进展生存期（PFS）的相关性。结果进展期胃癌ERCC1 mRNA的表达与化疗疗效（ORR）、PFS呈负相关（P=0.038和0.032）；ERCC1蛋白表达与FOLFOX4化疗疗效（ORR）无关（P= 0.089），与PFS呈负相关（P=0.039）。结论高海拔地区，进展期胃癌ERCC1 mRNA与化疗疗效呈负相关，ERCC1蛋白表达与化疗疗效无关；ERCC1 mRNA及蛋白表达与PFS呈负相关。

关键词：进展期胃癌；切除修复交叉互补基因1；化疗；高海拔地区

胃癌在中国属高发肿瘤，其死亡率占所有恶性肿瘤的23.02％，青海、宁夏、甘肃3省的胃癌死亡率超过35/10万。青海省西宁市海拔2295m，地处西北地区，胃癌具有发病率高、手术切除率低、生存期短、死亡率高等特点。大部分患者就诊时已属进展期，无手术机会；化疗是胃癌治疗的重要手段之一，是胃癌综合治疗的重要组成部分[1]。目前为止，铂类及5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）为治疗胃癌的基本用药。本研究探讨高海拔地区进展期胃癌切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）mRNA和蛋白表达水平，及其与化疗疗效的相关性。

1　资料与方法

1.1研究对象

选取2010年12月-2013年12月本院经病理学检查确诊的进展期胃癌70例进行研究。入选标准：①经证实具有可测量肿瘤病灶；②距离最后一次放化疗≥3个月；③化疗前血常规、肝、肾功能在正常范围内；④心电图正常；⑤美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分≤2分。排除标准：①ECOG评分≥3分；②肿瘤病灶不可测量；③风湿瓣膜性心脏病及器质性心脏病。入选患者手术切除的肿瘤组织置于-196℃液氮中保存，部分组织经过梯度酒精及二甲苯脱水后包埋于石蜡中，制备组织的石蜡标本。

所有患者有CT、B超及MRI证实的可测量肿瘤病灶。其中4例失访，3例不能按规定评估疗效，3例因不良反应未完成规定的治疗方案。最终60例患者符合标准，进行统计学分析。60例患者中，男性39例（65％），女性21例（35％）；年龄<55岁22例（36.7％），≥55岁38例（63.3％）；体力评价：0分40例（66.7％），1、2分20例（33.3％）。病理类型：腺癌46例（76.7％），黏液癌5例（8.3％），印戒细胞癌7例（11.7％），其他2例（3.3％）；分化程度：中、高分化23例（38.3％），低分化34例（56.7％），其他3例（5.0％）；民族：汉族49例（81.7％），回族6例（10％），藏族3例（5％），蒙古族2例（3.3％）。所有患者系长期居住高海拔地区（海拔2 200 m左右）。

1.2方法

1.2.1化疗方案和疗效评价所有患者采用FOLFOX4方案治疗。奥沙利铂（连云港江苏恒瑞医药股份有限公司，商品名：艾恒）85 mg/m2，第1天静脉滴注2 h；亚叶酸钙200 mg/m2，第1、2天化疗前静脉滴注2 h；5-氟尿嘧啶400 mg/m2，第1、2天静脉冲入；5-氟尿嘧啶600 mg/m2，第1、2天静脉持续泵入，14 d为1个周期。治疗前l周完成各项基线检查。近期疗效的评价按照实体瘤的疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST），分为完全缓解（complete response，CR）、部分缓解（complete response，PR）、疾病稳定（stable disease，SD）和疾病进展（progressive disease，PD）。以CR+PR为客观缓解率（objective response rate，ORR）。肿瘤无进展生存期（progress free survival，PFS）从治疗开始计算，终止日期为局部区域复发/远处转移或末次随访日。每两个周期评价疗效1次，若出现可能为病情进展的临床表现可提前评价疗效。所有患者进行随访。

1.2.2ERCC1蛋白检测采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidinperosidase，SP）检测胃癌石蜡切片组织中ERCC1的表达。ERCC1鼠抗人多克隆抗体为ab43（美国Abcam公司）。组织切片经高压处理，修复暴露抗原。每批染色设阳性和阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照组，以磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作空白对照组，严格按照试剂盒说明书进行操作，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色。免疫组织化学结果判断标准参照文献[2]，采用二级评分法进行，由2位病理医师判定。每张切片随机观察5个高倍镜视野，每个视野计数100个癌细胞。按显色强度分为4级：阴性（不着色）、弱阳性（着淡黄色）、阳性（着棕黄色）及强阳性（着棕褐色或者出现粗大的棕褐色颗粒），0～3分分别代表不同显色强度。同时计算阳性肿瘤细胞百分数，对阳性肿瘤细胞比例评分（阳性细胞0％为0.0分，1％～9％为0.1分，10％～49％为0.5分，>50％为1.0分），用阳性强度评分乘以阳性肿瘤细胞比例评分得到最后的半定量H值来衡量最终的蛋白表达强度。按照每个指标各自中位H值来确定胃癌组织中指标表达的高低。

1.2.3ERCC1 mRNA检测逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测ERCC1 mRNA的表达。Trizol试剂一步法提取胃癌组织总RNA，检测组织总RNA浓度及完整度，cDNA第一链合成，PCR扩增ERCC1和内参基因β-actin。ERCC1正向引物：5'-GCCTCC GCTACCACAACCT-3'，反向引物：5'-TCTTCTCTTGA TGCGGCGA-3'，产物长度313bp；β-actin正向引物：5'-CGGGACCTGACTGACTACCTC-3'，反向引物：5'-TCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'，产物长度545 bp。引物由上海英骏生物工程公司合成。反应体系为25μl，其中2μl cDNA模板，正、反向引物各1μl，2×PCR Master Mix 12.5μl，加双蒸水至25μl。反应条件：95℃预变性2 min，96℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃继续延伸10 min。反应结束后，取5μl PCR反应产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。紫外光下观察电泳结果，使用凝胶成像系统拍照记录。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料用χ2检验，生存分析用Kaplan-Meier法，各因素水平的比较用Log-rank法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1进展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA的表达

ERCC1蛋白阳性表达定位于肿瘤细胞核内，呈棕黄色或棕红色颗粒，偶见于胞浆内。60例标本中，ERCC1蛋白阳性表达率为35％。见图1。

图1　进展期胃癌组织中ERCC1阳性表达（免疫组织化学法×400）

以一个内体间标记60例进展期胃癌ERCC1 mRNA的表达变量，ERCC1/β-actin比率为0.160～0.821，中位比率为0.290。60例患者以中位值为界，分为ERCC1 mRNA高、低表达两组。进展期胃癌组织ERCC1 mRNA与β-actin表达见图2。

图2　部分胃癌组织ERCC1 RT-PCR检测结果

2.2ERCC1蛋白及mRNA表达与进展期胃癌临床特征的相关性

60例胃癌检测标本中，ERCC1蛋白及mRNA的表达与进展期胃癌患者临床病理参数，如不同年龄、性别、组织学类型及分级比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。

表1　进展期胃癌临床病理参数与ERCC1蛋白表达的相关性　例（％）

2.3进展期胃癌ERCC1蛋白与mRNA表达

青海地区60例进展期胃癌患者中，ERCC1蛋白阳性患者ERCC1 mRNA高表达为40％，ERCC1mRNA低表达为30％；ERCC1蛋白与mRNA的阳性表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

续表1

表2　进展期胃癌临床病理参数与ERCC1 mRNA表达的相关性　例（％）

表3　进展期胃癌中ERCC1 mRNA与蛋白表达的相关性例

2.4ERCC1蛋白及mRNA表达与FOLFOX4化疗疗效的相关性

所有60例患者完成≥4个周期的化疗后进行疗效评价并4周后确认。进展期胃癌ERCC1蛋白表达与化疗疗效无关（P=0.089）（见表4）；ERCC1蛋白阳性表达者ORR为19.0％，阴性者为43.6％。ERCC1 mRNA高表达ORR为20.0％，低表达为50.0％，ERCC1 mRNA的表达与化疗疗效呈负相关（P=0.038）（见表5）。

2.5进展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA表达与FOLFOX4治疗无进展生存期的疗效分析

对完成化疗方案的患者进行随访。ERCC1蛋白阳性表达者无进展生存期（6.24个月）较阴性者（7.23个月）短，差异有统计学意义（P=0.039）。以ERCC1 mRNA表达水平中位值为界，将患者分为高表达组和低表达组。ERCC1 mRNA低表达组的中位PFS为7.32个月，与高表达组的6.3个月比较，差异有统计学意义（P=0.032）（见图3）。Cox比例回归模型将年龄、性别、淋巴结转移、分化程度、ECOG评分等可能影响的因素进行多步骤校正后发现，ERCC1蛋白及mRNA表达仍然与PFS有关（P<0.05）。

表4　高海拔地区进展期胃癌化疗疗效与ERCC1蛋白表达的相关性　例（％）

表5　高海拔地区进展期胃癌化疗疗效与ERCC1 mRNA表达的相关性　例（％）

图3　进展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA表达与FOLFOX4化疗后PFS

3　讨论

ERCC1是第1个被发现的人类DNA损伤修复基因，是一种高度保守的单链DNA核酸内切酶。定位于染色体19q13.2～13.3，包含10个外显子，基因全长15×10 bp，编码含297个氨基酸的蛋白质[3]。化学药物造成的DNA损伤主要通过核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）途径修复，目前已明确ERCC1基因是核苷酸切除修复的关键基因[4]。

奥沙利铂是第3代铂类抗癌药物，其形成的铂-DNA复合物体积更大，能有更效地抑制DNA合成。然而肿瘤患者个体对草酸铂的敏感性迥然不同，耐药者与敏感者比较，生存期减少几倍甚至十几倍[5]。铂类耐药是因DNA的修复能力造成，其包含减少细胞毒的铂-DNA复合物形成，以及与铂-DNA复合物形成后防止细胞死亡[6]。其通过NER去除铂类药物导致DNA链内加合物被认为是铂类药物耐药的主要机制[7]，NER增强是导致顺铂耐药的一个重要机制。肿瘤细胞的DNA损伤修复能力不同会导致其对草酸铂的敏感性差异。

Kwon等[8]对韩国进展期胃癌患者接受奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶化疗的研究显示，ERCC1蛋白阳性率为70.3％，ERCC1蛋白阴性表达者有更好的化疗反应率及长的无进展总生存期（P=0.045和0.040）。Yun等[9]的一项对韩国进展期胃癌患者行一线铂类为基础的疗效及生存研究提示，ERCC1阳性表达率为66％，ERCC1阴性较ERCC1阳性患者有更高的治疗反应率（44％ vs 28％），但差异无统计学意义（P=0.420），ERCC1的表达与总生存期无关（P= 0.570）。但是也有不一致的研究，Baek等[10]对韩国>Ⅱ期胃癌患者行铂类术后辅助化疗的研究表明，ERCC1蛋白阳性组的无病生存期和总生存期明显较阴性组长。本研究结果显示，ERCC1蛋白表达阳性率为35％；进展期胃癌ERCC1蛋白表达与化疗客观有效率无关，与无进展生存期呈负相关；青海地区ERCC1蛋白阳性率表达较低，其治疗反应差可能与本实验入组患者分期晚及低分化腺癌比例较高有关，以及与不同地区胃癌的发病因素、发病机制及肿瘤的异质性相关，需要在以后的研究中扩大病例、分层分析。

黄朝晖等[11]在苏州地区用半定量RT-PCR检测62例胃癌组织ERCC1 mRNA表达水平的中位值为0.672；ERCC1 mRNA高表达组的无复发生存率和总生存率显著低于低表达组（P<0.05）。多因素分析结果显示，ERCC1 mRNA水平是影响患者预后的独立危险因素（P<0.05），与本研究结果相似，没有显示区域的差异。

Matsubara等[12]报道，140例进展期胃癌患者中43例接受铂类为基础的一线化疗，结果表明，ERCC1 mRNA低表达化疗反应率为55.6％，高表达化疗反应率为18.8％（P=0.008），所有患者多变量生存分析显示，ERCC1 mRNA高表达可预测不良预后。本研究显示，在高海拔地区，进展期胃癌ERCC1 mRNA表达与化疗客观有效率、PFS呈负相关。但是也有不同的报道，Huang等[13]研究长沙地区实施DCF方案化疗的48例进展期胃癌患者，TUBB3、TS和ERCC1 mRNA采用多通路Branched-DNA液态芯片技术测定，ERCC1 mRNA的表达高低与化疗反应率、中位疾病进展时间及中位总生存期无关。

总之，本研究探讨青海地区进展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA的表达，分析其与化疗的相关性，发现其与国内外研究的不同之处，所以在以后的研究中，既要扩大样本研究，又要将不同民族、不同分期进行分析，从而指导本地区进展期胃癌的个体化治疗。

参考文献：

[1] Peter S.Adjuvant chemotherapy in gastric cancer[J].World Journal of Surgery, 1987, 11(4): 473-477.

[2] Olaussen KA, Dunnant A, Fouret P, et al.DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J].N Engl J Med, 2006, 355(10): 983-991.

[3] Reed E.ERCC1 and clinical resistance to platinum-based therapy[J].Clin Cancer Res, 2005, 11(17): 6100-6102.

[4] Olaussen KA, Mountzios G, Soria JC.ERCC1 as a risk stratifier in platinum-based chemotherapy for non-small-cell lung cancer[J].Curr Opin Pulm Med, 2007, 13(4): 284-289.

[5] Kawakami K, Watanabe G.Identification and functional analysis of single nucleotide polymorphism in the tandem repeat sequence of thymidylate synthase[J].Gene Cancer Res, 2003, 63(18): 6004-6007.

[6] Steven W, Johnson, James P, et al.Cancer: principles and practice of oncology [M].6th ed.Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2001: 380-382.

[7] Su D, Ma S, Liu P, et al.Genetic polymorphisms and treatment response in advanced non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer, 2007, 56(2): 281-288.

[8] Kwon HC, Roh MS, Oh SY, et al.Prognostic value of expression of ERCC1, thymidylate synthase, and glutathione S-transferase P1 for 5-fluorouracil/oxaliplatin chemotherapy in advanced gastric cancer[J].Annals of Oncology, 2007, 18(3): 504-509.

[9] Yun J, Kim KM, Kim ST, et al.Predictive value of the ERCC1 expression for treatment response and survival in advanced gastric cancer patients receiving cisplatin-based first-line chemotherapy[J].Cancer Res Treat, 2010, 42(2): 101-106.

[10] Seo BG, Kwon HC, Oh SY, et al.Comprehensive analysis of excision repair complementation group 1, glutathione S-transferase, thymidylate synthase and uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1 polymorphisms predictive for treatment outcome in patients with advanced gastric cancer treated with FOLFOX or FOLFIRI[J].Oncol Rep, 2009, 22(1): 127-136.

[11]黄朝晖,华东,李莉华,等.ERCC1 mRNA表达及基因多态性对胃癌辅助化疗预后的影响[J].南京医科大学学报, 2008, 28(4): 453-455.

[12] Matsubara J, Nishiina T, Yamada Y, et al.Impacts of excision repair cross-complementing gene 1 (ERCC1), dihydropyrimidine dehydrogenase, and epidermal growth factor receptor on the outcomes of patients with advanced gastric cancer [J].British Journal of Cancer, 2008, 98(4): 832-839.

[13] Huang J, Hu HB, Xie YC, et al.Effects of TUBB3, TS and ERCC1 mRNA expressions on chemoresponse and clinical outcome of advanced gastric cancer by multiplex branched-DNA liquid chip technology[J].Translational Gastrointestinal Cancer, 2014, 3(1): 21-28.

（童颖丹编辑）

Correlation of ERCC1 mRNA and protein expression in advanced gastric cancer with chemotherapy effect in high-altitude areas*

Yu-juan Qi1, Jing-qi Han2, Bao-jia Cai2, Yu-shuang Luo2, Bao-yan Ji1, Qing-ling Yuan1, Xiao-yan Song1, Wen-yan Zhang1, Li-yan Bai3, Wu-jia Liu3
(1.Qinghai Provincial Peoples' Hospital, Xining, Qinghai 810007, China; 2.The Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining, Qinghai 810001, China; 3.Qinghai University, Xining, Qinghai 810016, China)

Abstract:Objective To investigate the values of mRNA and protein of excision repair cross-complementation group 1 (ERCC1) in predicting the prognosis of advanced gastric cancer patients treated with FOLFOX4 regime in high-altitude areas.Methods Seventy patients with advanced gastric cancer were enrolled in this study, 60 patients were eligible for analysis.All patients received FOLFOX4 regime repeated every two cycles.RT-PCR was used for analysis of ERCC1 mRNA; immunohistochemistry was used for analysis of ERCC1 protein expression.The relationships of mRNA and protein of ERCC1 with objective response rate (ORR) and progression-free survival (PFS) time were analyzed.Results ERCC1 mRNA expression was negatively associated with objective response rate (P= 0.038) and progression-free survival (P= 0.032).ERCC1 protein expression was not correlated with ORR of FOLFOX4 treatment (P= 0.089), but was negatively correlated with PFS (P= 0.039).Conclusions In high-altitude areas, the expression of ERCC1 mRNA in advanced gastric cancer patients is negatively correlated with PFS and ORR of FOLFOX4 treatment; the expression of ERCC1 proteinbook=1,ebook=82is not associated with ORR, but has correlation with PFS in advanced gastric cancer patients.

Keywords:advanced gastric cancer; excision repair cross-complementation group 1; chemotherapy; highaltitude area

*基金项目：青海省人力资源和社会保障厅2014年度留学人员科技活动择优资助项目（No：青人社厅函2014-414）

收稿日期：2015-09-14

文章编号：1005-8982（2016）01-0076-06

中图分类号：R735.2

文献标识码：A