人A431皮肤鳞状细胞癌中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路对P53的调节作用

郝玉琴，康春义，张鑫，康淑霞，刘侠（.内蒙古医科大学第三附属医院（包钢医院）皮肤科，内蒙古包头0400；.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特000）



人A431皮肤鳞状细胞癌中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路对P53的调节作用

郝玉琴1，康春义1，张鑫2，康淑霞2，刘侠2
（1.内蒙古医科大学第三附属医院（包钢医院）皮肤科，内蒙古包头014010；2.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110）

摘要：目的观察丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号通路的活化及抑制对皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞增殖、凋亡情况的影响，探讨MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53在皮肤SCC中的相互作用机制。方法培养人A431皮肤SCC细胞株，分为低、中、高浓度的MAPK/ERK通路抑制剂（PD98059+DMSO）组及激活剂（IGF+PBS）组、空白对照（DMSO）组。噻唑蓝法检测细胞体外增殖活力，流式细胞术（FCM）检测细胞的凋亡，Western blot检测各组A431细胞中P-ERK、P53蛋白表达。结果经不同浓度的抑制术PD98059处理A431细胞，细胞增殖受到抑制，呈浓度-效应和时间-效应关系（P<0.05）；经不同浓度的激动剂胰岛素样生长因子（IGF）处理A431细胞，细胞增殖受到促进，呈浓度-效应和时间-效应关系（P< 0.05）。FCM检测结果显示，PD98059作用于A431细胞，细胞凋亡率明显增高，呈浓度-效应关系（P<0.05）；而IGF作用于A431细胞，细胞凋亡率明显降低，呈浓度-效应关系（P<0.05）。Western blot检测结果显示，PD98059处理A431细胞，P-ERK蛋白的表达降低，P53蛋白的表达增强，随着PD98059浓度的增加，P-ERK蛋白明显降低，P53蛋白明显增强（P<0.05）；而IGF处理A431细胞，P-ERK蛋白的表达增强，P53蛋白的表达降低，随着IGF浓度的增加，P-ERK蛋白明显增强，P53蛋白明显降低（P<0.05）；经过Pearson相关性分析，P53 与P-ERK的表达呈负相关（P<0.05）。结论人A431细胞中MAPK/ERK信号通路被IGF激活后，促凋亡因子P53表达降低，细胞增殖能力增强，凋亡能力降低；而该通路受抑制后，促凋亡因子P53表达增高，细胞增殖能力降低、凋亡能力增强。

关键词：皮肤鳞状细胞癌；丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路；P53

恶性肿瘤的发生、发展涉及一系列信号转导分子活性的改变。其中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信号转导通路的持续活化是人类许多肿瘤的一个显著标志，其异常活化能导致细胞丧失凋亡和分化的能力，促使细胞恶性转化，异常增殖，产生肿瘤[1]。所以认为，靶向破坏该通路中的任何一个环节都能阻断该信号途径，抑制肿瘤细胞的增殖。本课题组及其他学者通过对某些肿瘤细胞的体内外研究却发现，肿瘤细胞经某些抗肿瘤药物治疗后，可以引起MAPK/ERK转导通路的活化和转录，同时启动P53依赖性凋亡途径，进而促进肿瘤细胞凋亡[2-6]。因此，MAPK/ERK转导通路与抑癌基因P53在恶性肿瘤中增殖、凋亡平衡中的作用值得探索，为研究MAPK/ERK信号转导通路提出新的挑战。目前，有关皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）中MAPK/ERK信号通路与P53作用的研究未见报道。因此，本研究通过应用MAPK/ERK信号通路激活剂类胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）及抑制剂PD98059干预人A431皮肤SCC细胞株，观察MAPK/ERK信号通路的活化及抑制对皮肤SCC细胞增殖、凋亡的影响，探讨MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53在皮肤SCC中的相互作用机制，为补充SCC的发生机制及治疗策略具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

IGF-1购自深圳晶美生物工程公司，PD98059购自美国Promega公司，胎牛血清、无血清细胞冻存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）高糖培养基、胰酶及无线电免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）细胞裂解液为美国Invitrogen公司产品，Annexin-V-FITC细胞凋亡试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品，四甲基偶氮唑蓝购于美国Sigma公司，兔抗鼠p53（BA0521）及P-ERK一抗为武汉博士德生物工程有限公司产品，增强化学发光法（enhanced chemilumnescence，ECL）试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒为美国Amersham Life Sciences公司产品，96孔反应板购自德国Roche公司。

1.2细胞培养

人A431皮肤SCC细胞株[购于南通百奥迈科（Biomics）生物技术有限公司，货号：CRL-1555，来源于美国ATCC公司]贴壁培养于DMEM（高糖型）完全培养基（含10％小牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素）中，置37℃、饱和湿度、5％二氧化碳CO2培养箱内培养，每1～2 d换液1次，细胞单层贴壁生长，待长满瓶底时，用0.25％胰蛋白酶消化液消化成单个细胞，取对数生长期的细胞准备实验。

1.3试验方法

实验分为低、中、高浓度的抑制剂（PD98059+DMSO）组及激活剂（IGF+PBS）组、空白对照（DMSO）组。抑制剂组PD98059浓度依次为25、50及100μmol/L；激活剂组IGF浓度依次为40、80及120 ng/ml。

1.3.1噻唑蓝比色法检测细胞体外增殖活力取处于对数生长期、生长状态良好的A431细胞以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔培养基体积200μl。待A431细胞贴壁24 h后，将不同浓度的药物PD98059或IGF加入A431细胞，37℃、5％CO2培养箱中继续培养至24、48及72 h，每孔加20μl MTT溶液（5 mg/ml），37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10 min，酶标仪测490 nm各孔光吸收值OD，实验重复3次，取3次结果的平均值，记录结果，以未加药细胞组作为空白对照组，计算细胞增殖抑制率/存活率，增殖抑制率（proliferation inhibitory rate，PIR）=（1-药物组OD/对照组OD）×100％；存活率（survival rate，SR）=药物组OD/对照组OD×100％，对照组SR为100％。

1.3.2流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞凋亡取生长状态良好的A431细胞加入PD98059 或IGF药物48 h后进行流式凋亡检测，独立实验3次。具体步骤如下：各组细胞经0.2％胰酶处理，离心收集细胞，用4℃预冷PBS洗涤2次，调节其浓度为1×106/ml，取100μl细胞悬浮于5 ml流式管中，加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl碘化丙啶（propodium iodide，PI）混匀，于室温避光孵育15 min。随后重悬于400μl PBS，400目筛网过滤，加样于流式细胞仪检测细胞凋亡。激发波长Ex= 488 nm，发射波长Em=530 nm。获得细胞凋亡数据后用ModFit LT软件进行细胞凋亡相对定量分析。

1.3.3凋亡相关因子的测定采用Western blot检测P53、P-ERK蛋白的表达，取生长状态良好的A431细胞加入PD98059或IGF药物48 h后进行Western blot检测。RIPA细胞裂解液抽提各组细胞总蛋白，按BCA试剂盒说明书操作步骤测定总蛋白含量后分装，置入-80℃冰箱冷冻待用。分别取50μg各组蛋白，煮沸10 min变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，电泳结束后，通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜在含10％脱脂奶粉的PBST中4℃封闭过夜后，PBST充分漂洗（10 min×3次），分别加入兔抗鼠P53、P-ERK（1∶300稀释）和兔抗鼠β-actin抗体（1∶800稀释），37℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次），加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶1 000稀释），37℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次）后，化学荧光法（ECL试剂盒，美国Amersham Life Sciences公司产品）显色，利用Image J灰度分析软件对Western blot检测结果作半定量分析。每份样品均设3个重复。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间数据的比较用方差分析及Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MAPK/ERK信号通路的活化或抑制对细胞增殖的作用

MTT结果显示，不同浓度的MAPK/ERK通路抑制剂PD98059处理不同时间的A431细胞，细胞增殖均受抑制。随着PD98059浓度的增加和作用时间的延长，PIR逐渐增加，呈浓度-效应和时间-效应关系（P<0.05）。见表1。

表1　PD98059对A431细胞增殖抑制率的作用

经不同浓度的MAPK/ERK通路激动剂IGF处理不同时间的A431细胞，可促进细胞增殖。随着IGF浓度的增加和作用时间的延长，SR逐渐增加，呈浓度-效应和时间-效应关系（P<0.05）。见表2。

表2　IGF对A431细胞存活率的作用

2.2MAPK/ERK信号通路的活化或抑制对细胞凋亡的作用

FCM检测结果显示，MAPK/ERK通路抑制剂PD98059作用于A431细胞，细胞凋亡率明显增高，随着药物浓度的增加，凋亡率明显增加，呈浓度-效应关系，各组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而MAPK/ERK通路激动剂IGF作用于A431细胞，细胞凋亡率明显降低，随着药物浓度的增加，凋亡率明显降低，呈浓度-效应关系，其中中剂量、高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3　PD98059/IGF诱导A431细胞凋亡

2.3相关凋亡因子P53、P-ERK蛋白的表达

2.3.1Western blot检测各抑制剂组P-ERK、P53蛋白的表达经不同浓度的MAPK/ERK通路抑制剂PD98059处理A431细胞，P-ERK蛋白的表达均降低，P53蛋白的表达均增强。随着PD98059浓度的增加，P-ERK蛋白明显降低，P53蛋白明显增强，与空白对照组比较，差异有统计学意义（FP-ERK=82.376，FP53=737.821，P<0.05）（见图1和表4）。

图1　PD98059各抑制剂组P53和P-ERK蛋白的表达

表4　不同浓度PD98059对A431细胞P-ERK、P53蛋白表达的作用（±s）

表4　不同浓度PD98059对A431细胞P-ERK、P53蛋白表达的作用（±s）

注：覮与对照组比较，P<0.05

PD98059　P-ERK/β-actin蛋白的表达　P53/β-actin蛋白的表达0μmol/L　0.887±0.070　0.155±0.006 25μmol/L　0.725±0.037覮　0.436±0.014覮F值　82.376　737.821 P值　0.000　0.000 50μmol/L 100μmol/L 0.548±0.066覮0.247±0.018覮0.843±0.134覮0.998±0.038覮

2.3.2Western Blot法检测各激动剂组P-ERK、P53蛋白的表达经不同浓度的MAPK/ERK通路激动剂IGF处理A431细胞，P-ERK蛋白的表达均增强，P53蛋白的表达均降低。随着IGF浓度的增加，P-ERK蛋白明显增强，P53蛋白明显降低，与空白对照组比较，差异有统计学意义（FP-ERK=534.577，FP53= 174.292，P<0.05）（见图2和表5）。

2.3.3各组A431细胞中P53与P-ERK蛋白表达的相关性分析通过观察发现，PD98059处理A431细胞，随P-ERK蛋白表达的降低，P53蛋白的表达升高，经过Pearson相关性分析，P53与P-ERK的表达呈负相关（rPD98059=-0.955，PPD98059=0.040）。IGF处理A431细胞，随P-ERK蛋白表达的升高，P53蛋白的表达降低，经过Pearson相关性分析，P53与P-ERK的表达呈负相关（rIGF=-0.987，PIGF=0.010）。

图2　IGF各激动剂组P53和P-ERK蛋白的表达

表5　不同浓度IGF对A431细胞P-ERK、P53蛋白表达的作用（±s）

表5　不同浓度IGF对A431细胞P-ERK、P53蛋白表达的作用（±s）

IGF　P-ERK/β-actin蛋白的表达　P53/β-actin蛋白的表达0 ng/ml　0.138±0.017　0.785±0.039 40 ng/ml　0.416±0.032覮　0.521±0.044覮F值　534.577　174.292 P值　0.000　0.000 80 ng/ml 120 ng/ml 0.641±0.029覮0.909±0.016覮0.328±0.029覮0.208±0.006覮

注：覮与对照组比较，P<0.05

3　讨论

恶性肿瘤的发生、发展与诸多因素相关，而细胞凋亡能力的异常降低与增殖能力的异常增强是其中一个关键因素。MAPK/ERK信号转导通路是将细胞表面信号转导至细胞核的重要传递者，在多数细胞的增生和程序化死亡的调节中具有重要意义。

本研究应用MAPK/ERK信号转导通路激动剂IGF作用于皮肤鳞癌A431细胞，P-ERK蛋白的表达升高，随IGF浓度的升高，P-ERK蛋白升高的更加明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P< 0.05）；而使用MAPK/ERK信号转导通路抑制剂PD98059作用于A431细胞，P-ERK蛋白的表达降低，随着PD98059浓度的升高，P-ERK蛋白明显降低，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。该结果验证IGF、PD98059可以分别做为MAPK/ERK信号通路的激动剂、抑制剂用于后续的实验。

本实验应用不同浓度MAPK/ERK转导通路激动剂IGF及抑制剂PD98059作用于皮肤鳞癌A431细胞中，采用噻唑蓝及流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡情况，结果显示，IGF促使MAPK/ERK传导通路活化后，可使A431细胞增殖能力增强，凋亡能力降低，且随着IGF浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐升高，凋亡率逐渐降低，呈浓度-效应和时间-效应关系；PD98059促使MAPK/ERK传导通路抑制后，可使A431细胞增殖能力降低，凋亡能力增强，并且随着PD98059浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率和凋亡率逐渐升增高，呈浓度-效应和时间-效应关系。该结果与其他研究者在其他肿瘤中的研究结果一致，即MAPK/ERK信号转导通路的持续活化可使SCC细胞丧失凋亡和分化的能力，异常增殖，产生肿瘤，而抑制该通路的活化可以使SCC细胞增殖抑制，凋亡能力增强，抑制肿瘤生长。

由于许多肿瘤组织中可检测到p-ERK表达水平的增高[7]，所以，目前在临床恶性肿瘤的化疗中，有许多药物是通过抑制ERK的活化来抑制肿瘤的生长。如用全反式维甲酸（all-trans retinoic acid/ATRA）处理乳腺癌细胞系SKBR-3后，ERK的磷酸化水平降低，导致SKBR-3细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制SKBR-3乳腺癌细胞的生长[8]。又比如，Lin等[9]通过对人类结肠癌HT-29细胞系的研究发现，番茄红素通过抑制P-ERK的活化从而抑制基质金属蛋白酶-7（matrix metalloproteinase，MMP-7）的表达及HT-29细胞侵袭。而Chang等[10]研究发现，Mesothelin蛋白在卵巢癌中高表达且与预后不良相关，Mesothelin可以通过活化MAPK/ERK通路，上调MMP-7的表达，从而增强卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。在体外实验中，通过应用ERK1/2抑制剂可以抑制MMP-7的表达。在动物体内实验中，小鼠应用MAPK/ERK抑制剂，可以减少肿瘤组织中MMP-7的表达，延缓肿瘤的生长，延长小鼠的生存期。所以Chang等[10]研究者认为，通过阻断Mesothelin相关的MAPK/ERK信号途径的转导对于卵巢癌的治疗具有重大意义。此外，MAPK/ERK通路抑制剂PD-0325901的一期药代动力学及药效学研究已应用于晚期癌症患者[11]。

野生型p53作为一种经典的抑癌基因，通过下调抑凋亡因子Bcl-2，上调促凋亡因子Bax，使Bcl-2/Bax比值下降，降低线粒体的跨膜电位，从而激活凋亡执行因子caspase-3引起细胞凋亡。

本实验Western blot检测结果显示，使用MAPK/ERK信号传导通路激动剂IGF作用于A431细胞，P53蛋白的表达降低，随着IGF浓度的升高，P53蛋白明显降低，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而使用MAPK/ERK信号传导通路抑制剂PD98059作用于A431细胞，P53蛋白的表达升高，随着PD98059浓度的升高，P53蛋白明显升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。且在激动剂各组及抑制剂各组中P-ERK的表达与P53的表达呈负相关。Western blot检测结果结合本实验MTT及流式细胞术结果，笔者认为，在皮肤SCC中，P-ERK维持在一定的水平，当IGF使MAPK/ERK信号通路进一步活化后，促凋亡因子P53蛋白水平降低，诱导细胞分化和凋亡的功能受抑，细胞异常增殖，产生肿瘤；反之，当使用PD98059阻断MAPK/ERK信号通路的活化，促凋亡因子P53蛋白水平增高，诱导细胞分化和凋亡，抑制肿瘤生长。

所以，明确皮肤SCC中MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53的相互作用机制，对于补充SCC的发生机制及治疗策略具有重要意义。

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（王荣兵编辑）

MAPK/ERK regulation of P53 in human epidermoid carcinoma cell line A431

Yu-qin Hao1, Chun-yi Kang1, Xin Zhang2, Shu-xia Kang2, Xia Liu2
(1.Department of Dermatology, Baogang Hospital, Inner Mongolia Medical College, Baotou,
Inner Mongolia 014010, China; 2.Inner Mongolia Medical College, Hohhot, Inner Mongolia 010110, China)

Abstract:Objective To observe the impact of activation or inhibition of MAPK/ERK signaling pathway on the proliferation and apoptosis of human epidermoid carcinoma cell line A431 cells, and to investigate the interaction mechanism between MAPK/ERK signaling pathway and tumor suppression gene P53.Methods Human A431 cells were cultured and divided into MAPK/ERK inhibition groups of low-, medium- and highconcentration of inhibitor (PD98059 + DMSO), MAPK/ERK activation groups of low-, medium- and highconcentration of activator (IGF + PBS) and blank control group (DMSO).The in vitro cellular proliferation was detected by MTT assay, the cell apoptosis detected by flow cytometry (FCM) and the protein expression of p-ERK and p53 detected by Western blot in each group.Results The A431 cell proliferation was inhibited bybook=1,ebook=30different concentrations of inhibitor PD98059 with a clear concentration-effect and time-effect relationship (P< 0.05), and the cell proliferation was promoted in the different concentrations of IGF with a clear concentrationeffect and time-effect relationship (P< 0.05).The FCM result showed a significantly increased A431 cell apoptosis rate with increased PD98059 in a concentration-effect relationship(P < 0.05); while the apoptosis rate decreased significantly with increased IGF also in a concentration-effect relationship (P< 0.05).The Western blot results showed that after PD98059 treatment the protein expression of p-ERK was reduced and the protein expression of p53 was enhanced, additionally the change of both expressions became much bigger when the concentration of PD98059 increased further with significant differences (P< 0.05).For the A431 cells treated by IGF, the protein expression of p-ERK was enhanced and protein expression of p53 was reduced with increasing concentrations of IGF, for which the differences were significant (P< 0.05) compared with the control group.The protein expressions of p-ERK and p53 were negatively correlated by Pearson correlation analysis (P< 0.05).Conclusions The activation of MAPK/ERK signaling pathway by IGF in human epidermoid carcinoma cell line A431 cells could reduce the expression of apoptosis factor p53, enhance cell proliferation capacity and reduce apoptosis capacity, while the inhibition of MAPK/ERK signaling pathway results in the increased expression of p53, decreased cell proliferation and enhanced apoptosis.

Keywords:cutaneous squamous cell carcinoma; MAPK/ERK signaling pathway; p53

*基金项目：2013年内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目（No：201303116）；国家自然科学基金（No：81260407）

收稿日期：2015-08-14

文章编号：1005-8982（2016）01-0024-06

中图分类号：R739.5

文献标识码：A