多肽固相合成的研究进展

刘立伟

摘 要：多肽是一类非常重要的生物活性物质，在治疗某些疾病方面具有独特的疗效，因此其化学合成有着非常重要的意义。文章介绍了多肽固相合成的原理、方法、固相载体的选择、连接分子的种类及肽键的形成等，揭示了固相合成多肽存在的问题并展望了其研究前景。

关键词：多肽 固相合成

1 多肽的概述

多肽是普遍存在于生物体内由氨基酸组成的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。在生物体内发现的多肽已达数万种，由于其具有广泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到药物研发工作者的重视。尤其在20 世纪90 年代以后，随着多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及畜牧业等领域。

合成多肽的方法主要是指化学合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法，无论是液相法还是固相法都已经很成熟。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成两种途径，它在多肽的工业化生产方面有非常重要的应用。与经典的液相合成多肽方法相比，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。

2 多肽的固相合成

1963 年Merrifield 提出固相多肽合成方法（ SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis） ，为多肽研究开辟了广阔的天地，并极大地推动了分子生物学等领域的发展，为此1984年Merrifield 被授予了诺贝尔化学奖。

2.1 固相合成的基本原理

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C 端（ 羧基端） 向N 端（ 氨基端） 合成。首先將目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。重复（ 缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合） 操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α- 氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc 固相合成法，α- 氨基用Fmoc（9- 甲氧羟基合成）保护的称为Fmoc 固相合成法。

2.2 合成方法

2.2.1 Boc 合成法

采用三氟乙酸（ TFA） 可脱除的Boc 为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc保护的α-氨基酸共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC 活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF 法或三氟甲磺酸（TFMSA） 将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc 合成法中，由于要反复地用酸来脱保护以便进行下一步的偶联，这就引入了一些副反应，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定并发生副反应。

2.2.2 Fmoc 合成法

1978 年，Meienlofer 和Atherton 等人发展了以Fmoc（9-芴甲氧羰基） 基团作为α-氨基保护基的多肽合成方法—Fmoc 法。在Fmoc 法中，采用了可被碱脱除的Fmoc 作为α-氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的Boc 保护方法。Fmoc 作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA 等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳的Boc 进行保护等。肽段最后用TFA/二氧甲烷（ DCM） 定量地从树脂上切除，避免了采用强酸。Fmoc 法与Boc 法相比，由于Fmoc 法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。

2.3 固相合成的聚合物载体的选择

将固相合成与其他多肽合成技术分开来的最主要的特征是固相载体，而能被用作多肽固相载体的聚合物必须满足以下条件： ①必须包含合适的连接分子（ 或反应基团） ，使肽链能连接在载体上面，并在以后除去。②必须在合成过程中保持稳定并且不与氨基酸分子反应。③必须提供足够的连接点，以满足肽链不断增长的需要。 目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类： 聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。根据连接分子的不同，树脂又被分为几种类型： 氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。

2.4 连接分子

一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定，并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子，同时连接分子还需要根据与树脂相连的肽的C 端的结构类型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物来选择。固相多肽合成使用过的连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。

2.5 肽键的形成

固相中肽键的形成原理与液相中的基本一致，应用的方法主要有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中选用DCC、HOBT 或HOBT /DCC 的对称酸酐法、活化酯法由于在肽键的形成过程中可以减少副反应并抑制消旋的发生，最终得到的多肽收率高等优点而应用最广。

2.6 多肽的切割，沉淀与纯化

按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有Boc 法和Fmoc 法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在Boc 法中，主要用TFA +HF 裂解和脱侧链保护。在Fmoc 法中直接用TFA进行切割。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。目前应用最多的是高效液相色谱法，

3 展望

固相多肽合成已经有50 年的历史了，但是，目前人们还只能合成一些相对较短的肽链，而对于相对分子质量较大、肽链较长的蛋白质类物质，固相合成技术还有很大的局限性。同时在合成中要用到大量的有毒试剂，合成费用昂贵，并伴随副反应、消旋化等问题，这些都是不可忽视的问题。而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题。同时，寻找更加绿色、环保的多肽合成技术，对科学家来说也是一个重大的挑战。

参考文献：

[1] 韩香，顾军.多肽的固相合成。天津药学，2002，14（7）：9.

[2] 李正超，韩香.多肽合成方法研究进展。武警后勤学院学报.2012，22（2）：153-158.