HIF-2对铁代谢的调节及其研究进展*

孙朝君 综述，耿 惠 审校

(1.青海大学研究生院 810000；2.青海大学附属医院血液科 810000)

HIF-2对铁代谢的调节及其研究进展*

孙朝君1综述，耿 惠2△审校

(1.青海大学研究生院 810000；2.青海大学附属医院血液科 810000)

缺氧诱导因子2；铁调节蛋白质类；转铁蛋白；受体，转铁蛋白；铁调节元件

据报道全世界有1亿4千万居民居于海拔2 500 m的地区，有1千7百万人口居住于海拔3 500 m以上的地区[1]。在高海拔地区缺氧可导致许多症状，如贫血和机体将氧运输到组织的能力降低。血红蛋白是运输氧的关键工具，它包含一个重要的微量元素-铁。铁对于许多生物过程如氧的运输都是必不可少的，它的供给受到严格的调控。然而缺氧条件下的铁代谢机制并未完全清楚。较早的研究表明，在缺氧环境下缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor1，HIF-1)是调节许多铁调节蛋白如铜蓝蛋白、转铁蛋白(Tf)和储存形式的铁蛋白转录的关键因子，而随后的研究表示HIF-2才是在铁代谢中发挥着重要作用的因子[2]。

1 HIF简介

HIF是20世纪90年代初，在研究低氧诱导的促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)基因表达时，从细胞核提取物中发现的参与氧稳态失衡调节的一个核心调节因子。HIF是一种基本的螺旋-环-螺旋异源二聚体，在氧平衡及适应缺氧中扮演着重要的角色。HIF由α和β两个亚基组成，其中α亚基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，α亚型受缺氧信号的调控，β亚基则在细胞内稳定表达。常氧情况下HIF-α持续合成，但半衰期不到5 min，即被迅速降解。HIF-α的氧依赖降解结构域(ODDD)中的脯氨酸残基被氧及亚铁离子依赖性的脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)羟化，从而增加HIF-α与肿瘤抑制蛋白(VHL)的亲和力。HIF-α与pVHL-泛素-蛋白酶复合体结合，经泛素-蛋白酶途径将HIF-α快速降解[3]。在缺氧及缺铁状态下，PHD羟化HIF-α的反应受阻，使其不易被降解，造成HIF-α在细胞内积聚，并由细胞质进入细胞核，与恒定表达的HIF-β结合形成二聚体，HIF与被招募入核的辅激活蛋白p300/CBP结合，形成DNA结合复合体，结合于缺氧反应元件(HRE)位点，促进低氧反应基因的转录，引起细胞对低氧的一系列适应性反应[4]。其中HIF-1是Semenza等于1991年在诱导肝癌细胞株Hep3B细胞核提取物中发现的一种转录因子，它在人体组织中广泛表达，最初的研究表明HIF-1是低氧环境下调节EPO的主要调节因子，而随后的研究发现HIF-2才是调节EPO的主要因子[5]。HIF-2最早是在1997年由Tian等[6]克隆出来的，由功能性HIF-2α亚基和结构性HIF-1β亚基共同组成的异源二聚体。其代谢途径与HIF-1相似。HIF-2表达谱相对较窄，缺氧条件下，HIF-2在多种组织器官如内皮、肺、心、肝、肾、脑、肠、胰腺的特定细胞中稳定表达，主要负责调节肿瘤生长、细胞周期与维持干细胞多功能性等方面的基因。尽管HIF-1和HIF-2共享许多转录靶点，但某些基因和过程似乎没有共同调节，例如无糖酵解似乎主要有HIF-1α调节，而EPO的合成和铁代谢为HIF-2α的调节过程。HIF-3α亦广泛表达于各组织，但其功能目前仍未清楚阐明。

2 铁在常氧环境下的代谢机制

血清铁的水平主要依赖于肠道由食物中摄取、血液运输、衰老红细胞被吞噬释放出的铁循环再利用及其他组织如肝脏储存铁的释放。用于正常红细胞生成的大多数铁来源于衰老红细胞被吞噬释放出的铁循环再利用。衰老红细胞被巨噬细胞吞噬，释放出血红素铁，经膜铁转运蛋白(FPN)转运入血。膳食中的铁主要吸收部位在十二指肠及空肠上段，三价铁被十二指肠上皮细胞肠腔面的细胞色素B(DcytB)还原为二价铁，随后由二价金属离子转运蛋白1(DMT-1)转运至细胞内。转运至细胞内的二价铁可以以铁蛋白的形式储存，或与基底面的FPN结合并转运入血。FPN通过循环中的铜蓝蛋白和基底膜上的亚铁氧化酶将二价铁氧化为三价铁，才能与Tf结合，通过血液循环与肝细胞表面的Tf受体(TfR)结合并利用。小肠对铁的吸收由多种信号通路共同调控，缺氧时通过HIF-2调节，肠上皮细胞的铁量由铁调节蛋白/铁反应元件(IRP/IRE)调节，机体铁量由铁调素调节。

3 HIF-2对铁调素的调节

铁调素是由肝脏合成及分泌的抗菌多肽，由HAMP基因编码。最早由Krause于2000年从人血中分离出来，铁调素高表达于肝细胞，其表达受到铁储存、贫血、缺氧及炎症等多种因素调节。HIF影响铁调素的分子调控，进而影响铁代谢。铁调素被描述为“铁稳态主要调节器”，它通过十二指肠上皮细胞影响着铁的吸收，并且影响巨噬细胞和其他铁输出细胞铁的释放。而进一步与膳食铁摄取没有直接关系的一系列因子也影响着铁调素的水平，如炎症、红细胞生成增多和缺氧。在2001年，人们发现当膳食中铁负荷过载时，铁调素就会过度表达，进而提出铁调素也许是一种调节铁稳态的重要调节器[7]。随后的研究证明了以上的假设。铁调素主要是通过与FPN结合来调节铁稳态，FPN是十二指肠黏膜、巨噬细胞和胎盘合体滋养层惟一能将细胞内铁转运至细胞外的转运体。铁调素与FPN在细胞表面结合，使FPN内化并降解[8]。Nicolas等[9]发现缺氧时铁调素表达降低，然而具体的生理及缺氧调控铁调素的机制仍不十分清楚，且互相矛盾。在细胞培养和动物实验研究中，以及红细胞增多症患者的临床数据均支持铁调素的合成涉及VHL/HIF/PHD轴这一概念[10]。然而铁调素氧依赖的分子机制，尤其是HIF对其调节中所扮演的角色并不清楚。通过转录测定法对铁缺乏小鼠进行遗传研究提出肝细胞中活化的HIF-1可以通过低氧反应元件(HRE)依赖机制直接抑制铁调素[11]。而这一论点存在争议，且最近更多的体内试验表明HIF并未起到直接抑制HAMP转录的作用。另一缺氧诱导铁调素抑制的模型是通过铁依赖信号途径控制HAMP的转录。信号通过遗传性血色素沉着病的患者体内突变产生的HFE基因、TfR1、TfR2或铁调素调节蛋白(HJV)从而增加铁调素的表达。体内研究表明HIF诱导弗林蛋白(一种蛋白原转化酶)将HJV转化为可溶性HJV，竞争骨形态发生蛋白6(BMP6)从而拮抗HJV对HAMP转录的信号转导[12]。同样的，跨膜丝氨酸蛋白酶6(TMPRSS6)，即蛋白裂解酶-2，是一种铁调素抑制剂，已被证实是由HIF调节的，并推测在缺氧环境下TMPRSS6可钝化BMP6/HJV调节信号[13]。也有一些机械学说提出低氧抑制铁调素，最简单的模型是HIF-2增加肾脏EPO的生成和“红细胞生成驱动”，从而间接抑制铁调素。据推测，红细胞生成增强一种骨髓发出的系统信号，导致铁调素在肝脏受抑制，这样就可以增加FPN在细胞膜表面表达，从而增加红细胞生成所需的可利用铁。这一信号的候选因子是生长分化因子15(GDF15)，受铁和氧调控(依赖HIF)，属于转化生长因子超家族的成员[14]。Liu等[15]用基因方法抑制HIF激活EPO的合成，发现HIF对HAMP的抑制调节需要EPO诱导。EPO诱导与红细胞生成增加及血清中高水平的GDF15有关。当红细胞生成受到药物抑制，即使血清中EPO处于高海拔地区HAMP水平仍不再受到抑制，提示EPO并非自己直接调节HAMP。研究证明HIF通过诱导EPO合成刺激红细胞生成来抑制HAMP。而已有研究证明缺氧环境下HIF-2是调节EPO的主要因子。Mastrogiannaki等[16]使用敲除铁调素基因的小鼠，将其肠细胞的HIF-2α删除，发现可以明显减缓组织铁过载的程度，提示HIF-2在铁调节方面起着重要作用。

4 HIF-2对DcytB及DMT-1的调节

铁从肠腔向循环系统定向转运需要一系列的精确调控，这一体系包括DcytB、DMT-1、FPN和辅助蛋白，在哺乳动物新陈代谢中维持铁稳态。这一肠道转运过程包含转录中HIF-2调节及转录后IRP/IRE调节。已有两项独立研究表明DcytB受HIF-2的转录调控。DcytB是哺乳类动物体内的一种血浆铁还原酶，催化膳食中的三价铁还原为二价铁，随后由DMT1转运至细胞内。Shah等[2]发现当低铁喂养小鼠两周导致小肠铁缺乏时，可导致 DcytB 和 DMT-1表达增加，从而增加铁的摄入，与此同时HIF-2α活性增加而 HIF-1α基本不变。当HIF信号途径被破坏时，铁缺乏导致的DcytB和DMT-1表达增加的效应消失，造成机体铁缺乏和贫血。Mastrogiannaki等[17]研究发现十二指肠上皮细胞处于缺氧状态可避免 HIF-2α的降解，从而促进肠道内铁的吸收，当特异性敲除HIF-2α基因时，可造成血清铁水平降低和肝脏铁减少，DcytB和DMT-1表达降低，但HIF-1α特异性敲除则没有这种效应。两项研究均表明 HIF-2α是参与调控小肠铁吸收相关基因的表达和铁摄取的重要因子。Luo等[18]应用Western blot及定量PCR方法研究DcytB与HIF-2的关系，发现HIF-2沉默时DcytB和DMT1的表达降低。研究结果亦进一步证明了HIF-2可上调DcytB和DMT1的表达。分析表明DcytB和DMT1都存在HRE序列，体外实验证明这些序列都可与HIF-2α结合而使基因表达增加。前期研究已表明HIF对机体铁代谢的调节受到VHL的影响，VHL通过对HIF-2α泛素化修饰而实现对HIF-2α含量的调节[19]。缺氧时氧及亚铁离子依赖性的脯氨酸羟化酶对HIF-2α的羟基化修饰作用减弱，VHL无法进行泛素化修饰，HIF-2α活性增加，与HIF-β形成异源二聚体，同时在转录调节蛋白辅助下诱导 DcytB 和DMT1 基因表达，进而促进铁吸收。

5 HIF-2对Tf、TfR的调节

Tf是一种由698个氨基酸组成的糖蛋白，他由肝细胞分泌至血浆，可以结合两个三价铁。Tf是脊椎动物血清中主要的铁结合蛋白，未与铁结合的Tf通常被称为脱铁运铁蛋白。Tf与血浆中细胞膜上的TfR具有高亲和力。低氧环境下Tf mRNA的表达受HIF依赖方式的调节，Tf的转录起始点上游的第3 300～3 600位点发现增强子中存在2个HRE，二者均可与HIF结合，但是3′端的HRE要比5′端的亲和力低。在缺氧条件下HIF与Tf的HRE结合致使Tf的mRNA和蛋白的表达均增加[20]。TfR1和TfR2分别是由760个氨基酸和801个氨基酸组成的蛋白。TfR2可以与Tf结合，但是其亲和力较TfR1要低得多。TfRs 包含一个位于细胞质中短的N端、一个独立的跨膜区及一个位于细胞外的长的C端。一旦与载铁的Tf结合，TfR便通过受体介导的内吞作用被内化，细胞核内较低的pH值将三价铁还原为二价铁，并释放Tf。释放的二价铁通过DMT-1离开细胞核转化为可利用形式的铁蛋白、膜FPN、合成亚铁血红素或与非血红素铁结合蛋白结合。TfR1在缺氧环境下通过HIF依赖方式调节。在人类TfR1基因转录起始位点上游的增强子80～93碱基对之间存在HRE。单一的HRE突变可以使缺氧对TfR1的调节消失。另外，在人类TfR1 mRNA中发现存在5个IRE位点。当氧水平低时，IRP-1与TfR1中IRE的结合减少，然而IRP2与TfR1中IRE的结合增加[21]。所有的TfR1中IRE-IRP2相互作用的结果都是在低氧环境下稳定TfR1 mRNA及增加TfR1蛋白的表达。研究认为缺氧环境下稳定TfR1的生理意义是通过红细胞增加铁的摄取[22]，对于最佳的血红蛋白及红细胞生成至关重要。

有研究表明，HIF维持铁稳态的直接靶器官包括Tf和TfR，后者与Tf具有高亲和力[23]。Tf用于运输三价铁形式的血清铁至靶器官，血红蛋白合成消耗的铁大部分来自血浆中的Tf，而这一过程需要红系细胞膜表面TfR的高表达。研究表明在红细胞分化时TfR水平急剧增加发生在转录水平，该研究通过调查小鼠白血病细胞中TfR启动子活性剂及DNA-蛋白质结合来研究TfR的转录调节，发现TfR mRNA的启动子区含有HRE，在低氧环境下可以与缺氧诱导因子结合，进而促进TfR的表达[24]。缺氧会诱导 HIF的表达量增加，进而通过调节这些铁代谢蛋白参与调控铁稳态[25]。缺氧条件下，TfR的表达调控呈现HIF依赖模式，说明 HIF可以通过调控TfR，进而调节铁稳态。Rankin等[26]发现，在小鼠肝细胞中敲除HIF-2基因可使肝组织Tf表达水平显著减低，提示HIF-2可能诱导Tf基因表达。虽然已有大量研究表明调节铁代谢的主要是HIF-2，但是TfR在低氧环境下具体是由HIF-1调节还是由HIF-2调节目前尚不清楚。

6 HIF-2与IRP-1的相互调节

IRP-1的作用是作为细胞内铁的传感器，通过与相关蛋白mRNA的IRE结合，调控经典的铁敏感基因表达，如TfR、铁蛋白及DMT-1[27]。Ghosh等[28]将野生小鼠及敲除IRP-1基因小鼠的肺内皮细胞分别在低氧环境下培养，发现无论是正常铁膳食还是低铁膳食，敲除IRP-1基因的小鼠HIF-2α蛋白表达均明显升高，然而mRNA水平却未升高。HIF调控的一些靶点如内皮素-1、BMP等的表达也有增加。相反，HIF-1α在敲除IRP-1基因的小鼠肺内皮细胞中的表达并未改变。表明HIF主要的PHD降解通路并没有改变。因此，HIF-2表达的改变并不是转录改变或降解通路改变导致的，有可能是IRP-1缺失导致翻译抑制剂失活致HIF-2表达增加。HIF-2表达增加，从而使受HIF-2调控的靶基因包括EPO表达增加，因此红细胞生成增加，导致红细胞增多及组织内铁重分布用于红细胞的生成。HIF-2作为EPO的主要调节器，也受到缺氧、贫血及铁状况的调节，通过PHD2/VHL调节HIF-2的降解通路。有研究表明HIF-2α mRNA的5′端也含有非编码区IRE，是一种茎-环结构，在细胞内铁水平降低时与IRP-1结合[29]负向调节HIF-2，这反过来限制EPO的生成，从而调节低氧诱导红细胞生成对铁的可利用性。当低氧环境下红细胞生成消耗铁过多时，细胞内铁降低，IRP与HIF-2 的mRNA 5′端非编码区的IRE结合，抑制HIF-2的表达，进而减少EPO的合成，使红细胞生成减少，从而减少铁的消耗。随后Luo等[30]通过培养哺乳类HepG2细胞并进行生物化学处理，研究IRP-1的调控在低氧环境下的潜在分子机制，发现在短暂缺氧环境下HepG2细胞内的IRP-1 mRNA及蛋白质水平均降低，且通过Genomatix MatInspector软件分析得出IRP-1的5′调控区含有HRE，可与HIF-1结合进而通过HIF/HRE系统负调节IRP-1。表明低氧环境下HIF可以与IRP-1 5′调控区的HRE结合调节IRP的表达，进而调控铁的代谢。但是这一研究发现仅在短暂缺氧时IRP受HIF的调控表达减低，而在长期缺氧时IRP mRNA水平是上调的。因此提出低氧环境下对IRP的调控可能存在两种机制。低氧环境下HIF对IRP的调节机制至今仍未能阐明。

目前低氧环境下铁代谢的调节机制尚未完全解释清楚，有研究表明HIF-1为主要调节因子，也有研究证实HIF-2是调节铁稳态的主要因子。且HIF对铁代谢的调节通路也未清楚阐明。关于HIF-2对铁代谢的调节机制还有许多问题尚待研究。

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青海省应用基础研究计划项目(2014-ZJ-720)。

孙朝君(1987-)，住院医师，硕士，主要从事血液病学研究。

△通讯作者,E-mail:gh0227@sina.com。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.043

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1671-8348(2016)10-1414-04

2015-12-28

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