土壤中以抗生素为单一碳源的抗性细菌

顾 超，张奇春，徐晨光

（浙江省亚热带土壤与植物营养重点实验室/污染环境修复与生态健康教育部重点实验室/浙江大学环境与资源学院，310058）

土壤中以抗生素为单一碳源的抗性细菌

顾 超，张奇春*，徐晨光

（浙江省亚热带土壤与植物营养重点实验室/污染环境修复与生态健康教育部重点实验室/浙江大学环境与资源学院，310058）

通过单一碳源选择性培养基（sole carbon source，SCS），从4种不同利用类型的土壤中分离得到2株以青霉素为碳源的菌株（p4，p5）以及3株以四环素为碳源的菌株（t1，t5，t9），5种菌株均为革兰阴性菌.研究结果表明抗生素能刺激相应抗性菌株的生长.分别将p4，t5，t9菌株接种到100 mg/L相应抗生素SCS培养液中，30 d后培养液中抗生素质量浓度与不接种菌株的培养液相比分别下降19.5%，29.1%，24.9%.通过系统发育分析，5种菌株分别属于溶杆菌属（Lysobacter）、贪噬菌属（Variovorax）、假单胞菌属（Pseudomona）、噬几丁质菌属（Chitinophaga）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），说明土壤中以抗生素为单一碳源分离的抗性细菌具有群落结构多样性，甚至有菌株与机会致病菌相关，应引起重视.

抗生素；单一碳源；系统发育分析

SummaryResistance genes and strains were increased significantly with antibiotic accumulation in soil.Some resistant strains showed multiple drug resistance.Resistance genes can not only transfer between different species of bacteria，but also to humans by edible crops.Thus，the harm of resistant strains to the environment and human health is alarming.Studies showed that many microorganisms grew in an extreme environment and could degrade toxic substances，therefore，there must be some bacteria living with antibiotics as carbon sources for growth in the environment.Although many studies reported antibiotic resistant strains，little effort had been found in the literature to isolate strains with antibiotics for carbon sources.With the aim to promote domestic antibiotic resistance genes related research development of new antimicrobial agent，we studied growth characteristics and phylogenetic positions for strains with penicillin or tetracycline as the sole carbon source.

We collected four kinds of soil（forest soil，tea garden soil，farm soil，and hospital nearby soil）with a potential antibiotic accumulation for the experiment.Sole carbon source medium with penicillin or tetracycline was used to isolate strains.The pu__rity of each reagent in the medium was more than 99.5%.Morphological observation andgram staining were carried out after inoculating culture.Growth curves of strains and antibiotic concentrations in the medium were analyzed to understand the characteristics of the strains using antibiotics.Primers 27F and 1492R were used for strains 16S r RNA genes amplification to determine phylogenetic positions of strains.

We isolated five soil bacterial strains（p4，p5，t1，t5，t9）from soil with the capacity to grow on antibiotic as sole carbon source.The strains of p4，p5are resistant to penicillin and the other three are to tetracycline.The strain of t1was isolated from the tea garden and other four strains were isolated from the forest soil.Five strains were all gram-negative bacteria.The results showed that antibiotics were limiting factors for these bacteria and antibiotic could stimulate the strains growth.The concentration of penicillin and tetracycline degraded 22.6%and 16.5%，respectively，after inoculation compared with the control in 100 mg/L sole carbon source（SCS）antibiotic medium. It showed that the isolates could use antibiotics as carbon sources to support their own growth.The bacterial isolates were identified based on analysis of the 16S r RNA gene sequences.They were placed into a phylogenetic tree and were considered to be surprisingly diverse.They were classified into five distinct genera，Lysobacter genus，Variovorax genus，Pseudomona genus，Chitinophaga genus and Brad yrhizobium genus，respectively.It is concluded that there are a considerable number of microbes in soil that can grow with antibiotics as the sole carbon source，unlike previous resistant bacteria，and the increase of concentration of antibiotics can stimulate the growth of strains.In theory，the strain can degrade antibiotics in soil，but as a kind of environmental pollutants，the ecological risk of isolated strains still needs further study.Although the mechanism of strains resistance is not obvious，we are sure that these strains are diverse in phylogenetic positions.

抗生素已被广泛地用来保护人类的健康，此外由于抗生素成本低，在畜禽业及水产养殖业中，用作动物的疾病预防剂及生长促进剂来提高生长速率获得较大的经济效益［1］.中国是世界上最大的抗生素生产和消费国，年产21万t［2］，每年有2.8万t的青霉素和1万t的土霉素生产，分别占世界总产量的60%和65%［3］.大多数医药抗生素被设计成能够迅速从体内排出，因此，通常多达30%～90%的抗生素以母体化合物排出体外［4］.长期服用抗生素的养殖动物，其肠道菌群产生耐药菌株，耐药基因随粪便进入环境；另外，水产养殖废水、制药厂废水和医院废水等排放致使环境中抗生素污染物不断积聚进而诱导耐药基因.研究表明，自1940—2008年，土壤中的抗生素耐药基因数量急剧增长［5］.

土壤生态系统是高度复杂的，包含了多种细菌和真菌的物种［6］.THIELE［7］研究表明，土壤环境受抗生素类污染物的影响而发生显著的微生物活性和抗性群落变化，绝大多数的土壤微生物还没有被认知，而且关于土壤微生物群落结构与土壤性能之间的理论较少.DANTAS，等［8］在没有明显受到抗生素影响的土壤中分离出许多超高耐药细菌，这些耐药菌甚至可以利用抗生素为碳源来维持自己的生长，而且呈现出耐药菌落的多样性，系统发育中的亲缘关系十分广泛，但是关于它们的传播模式和扩散机制目前还很不清晰，国内也未见有此类菌株的相关报道.青霉素和四环素都是人畜共用药物，不仅可以在临床上用来杀菌，而且还可以作为生长促进剂饲养动物［1］.因此，本研究试图从不同类型土壤中分离出能以青霉素或四环素为单一碳源生长的抗性细菌，并对其进行系统发育鉴定.

1 材料与方法

1.1 供试土壤

分别选取茶园、森林、养殖场、医院周边作为土样采集点.茶园位于杭州市龙井村，为丘陵地，植被为茶树，长年施用有机肥；森林位于龙井八景丘陵上，植被为多年生林木，树种主要有柳树等；养殖场位于浙江大学华家池校区；医院位于浙江大学紫金港校区校医院.在各点周边，随机取20个表层（0～20 cm）土样，采集后拣去植物残体混合，分成2部分，一部分鲜土直接过2 mm筛用于抗性细菌的分离；另一部分土样风干后，研磨分别过2 mm和0.25 mm筛，用于土壤理化性状的测定.供试土壤的基本性质采用常规分析方法进行测定［9］，基本性质见表1.

1.2 单一碳源（sole carbon source，SCS）培养基配制

根据DANTAS，等［8］研究中的配方配制基础培养液，然后用NaOH或稀HCl调节p H至6.2～6.5，放入高压灭菌锅中灭菌后冷却，加入已过0.22 μm微孔滤膜一定量质量浓度的青霉素或四环素溶液即得溶液SCS抗生素培养基；取p H 6.2～6.5的基础培养基，按15 g/L加入琼脂，然后放入高压灭菌锅灭菌15 min，冷却至40～45℃时加入已过0.22μm微孔滤膜一定质量浓度的青霉素或四环素母液，配成不同质量浓度的固体SCS抗生素培养基.

表1 4种供试土样基本理化性质Table1 Basic physical and chemical properties of the four tested soils

1.3 以抗生素为单一碳源菌株的筛选

称取1 g鲜土加入盛有高压灭菌后的50 m L磷酸盐缓冲溶液（PBS:1.44 g/L Na2HPO4·2 H2O，0.24 g/L KH2PO4，8.00 g/L NaCl和0.20 g/L KCl的混合溶液）的三角瓶中，用手摇动三角瓶1 min以混匀.然后吸取1 m L上述土壤溶液加入到装有9 m L抗生素SCS（含抗生素为1 000 mg/L）培养液的试管中，培养1周后，重复操作1次，稀释4次后，用移液枪吸取稀释液200μL接种到含抗生素1 000 mg/L的固体SCS-抗生素培养基中，用涂布棒涂匀，倒置放入28℃培养箱中培养（以上实验过程中所用的枪头、试管，固体和液体培养基等均经过高压灭菌），直至固体抗性培养基表面长出菌落，再通过平板划线得到纯培养物.

1.4 菌株生长曲线绘制

取分离菌平板，无菌操作挑取1环菌落，接入含有1 000 mg/L青霉素抗生素SCS液体培养基中，静置培养18 h作种子培养液.每个菌种准备8个盛有相同体积液体培养基的三角瓶（培养基分为含有抗生素100和1 000 mg/L的SCS-抗生素液体培养基），定量接入种子液，28℃振荡培养，分别于1:00、4:00、8:00、12:00、16:00、20:00、24:00取出，立即放入冰箱贮存，待培养结束进行光密度值（D）测定，以未接种的培养基作对照，600 nm波长分光光度计上调零点.

1.5 SCS培养液中抗生素质量浓度的测定

分别将分离的菌株接种到含抗生素质量浓度为100 mg/L的SCS培养液中进行培养，分别在培养第1天、第10天、第20天和第30天时用无菌枪头吸出培养液10 m L进行抗生素分析.

青霉素测定方法:青霉素的测定采用高效液相色谱串联质谱法测定.将吸出的SCS-青霉素培养液准确稀释1 000倍.吸取稀释后样品2 m L于10-m L塑料离心管中，精确加入4 m L乙腈，1 000 r/min涡旋振荡2 min，2 800 r/min离心4 min，精密移取5 m L上清液至另一10-m L塑料离心管中，加入2.5 m L正己烷，2 000 r/min涡旋振荡1 min，静置，待分层后弃去上层溶液，下层溶液于45℃水浴中氮气吹干，用1 m L 水-乙腈（90∶10）溶解残渣，0.45μm微孔滤膜滤过，滤液再用0.2μm微孔滤膜滤过，作为供试液，供LC-MS/MS检测［10］.

四环素测定方法:采用高效液相色谱法测定培养液中的四环素.将吸出的SCS-四环素培养液精确稀释1 000倍.用C18吸附柱固相萃取法提取水样.分别用10 m L甲醇和10 m L EDTA（2 g/L），以3.0 m L/min速度对C18吸附柱进行活化处理.吸取稀释后培养液8 m L用稀硫酸调至p H＜3，以10.00 m L/ min的速度流过CL8吸附柱，用5 mL纯水以5.0 mL/ min速度清洗小柱，以除去EDTA，然后用氮气吹吸附柱20 min以除去吸附柱上的水分，用8 m L含0.01 moL/L草酸的甲醇以1.0 m L/min速度淋洗吸附柱（其中2 m L先浸泡吸附柱），收集淋洗液［11］.

1.6 菌株观察和染色

菌株的肉眼和光学显微镜观察参照《伯杰细菌鉴定手册》［12］.革兰染色参考《微生物学实验》［13］.

1.7 分子生物学鉴定

所分离的抗生素耐药菌按照传统方法进行DNA的提取，采用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-TACCTTGTTAC GACTT-3′）分别对菌株总DNA中的细菌16S r DNA片段进行扩增.20μL反应体系如下:10倍PCR缓冲液2μL，dNTP混合液（各2.5 mmol/L）1.6μL，MgCl2（25 mmol/L）1.2μL，引物27F（10 μmol/L）1μL，引物1492R（10μmol/L）1μL，DNA模板1μL，Taq酶（5 U/μL）0.1μL，dd H2O 12.1 μL.PCR反应条件:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸7 min.扩增产物直接送上海生工生物工程公司进行测序.

1.8 数据分析

采用Microsoft Excel 2007软件对数据进行处理和绘图，采用MEGA5.0，用邻接法构建系统发育树.

2 结果与分析

2.1 以青霉素或四环素为单一碳源的生长抗性细菌筛选

从4个不同利用类型的土壤中共筛选到以青霉素为碳源生长的菌株2株（p4，p5），均分离自森林土壤；以四环素为碳源生长的菌株3株（t1，t5，t9），其中t1分离自茶园土壤，t5和t9分离自森林土壤.各菌株革兰染色和形态观察结果（表2）表明，5种菌株均为革兰阴性菌，菌落大小在0.1～2 mm，菌落均为圆形且表面凸起.目前，在全球范围内，革兰阴性致病菌感染引起的致病率和病死率占主导地位［14］.可见，浙江土壤中存在能以抗性素为单一碳源生长的抗性细菌，虽然相对数量较小，但是根据研究报道这些能以抗性素为碳源的细菌具有耐药的多样性，而且许多与致病性相关［15］.有趣的是，虽然养殖场和医院用地土壤由于抗生素的应用抗性基因增加，本次实验中却未分离到相关微生物，而森林土壤未受到干扰却分离到了以抗生素为碳源生长的抗性细菌.相关研究表明大多数产抗生素菌株都携带对其抗生素的耐药性基因［16］，自然界中的风、水流、野鸟等都是抗生素抗性基因传播的重要驱动力［17］，因此即使是未受人为影响的森林土，其土著微生物都有可能获得耐药性基因而变成耐药菌.本研究结果说明土壤即使未受干扰的林地存在能以抗生素为单一碳源的菌株，是耐药菌的储存库，应引起足够的重视.

表2 革兰染色和菌落形态观察Table2 Gram staining and the morphology observation of the five strains

2.2 菌株的生长特性分析

为了解菌株的生长特性与培养液中抗生素的关系，分别将p4、p5接种到青霉素质量浓度为100和1 000 mg/L的SCS培养基中，将t1、t5、t9接种到四环素质量浓度为100和1 000 mg/L的SCS培养基中.生长曲线结果（图1）表明，5个菌株在监测的60 h内都呈现了完整的生长过程（迟缓区、对数区、稳定期、衰亡期）.p4，p5菌株在100 mg/L青霉素SCS中40 h时吸光值最大，而在1 000 mg/L抗生素时生长速度明显加快，在20 h时D（600 nm）值达到最大，并且菌株稳定期更长.t1，t5，t9在2种质量浓度抗生素培养液中的生长曲线规律与p4，p5类似，3种菌株在较低质量浓度抗生素培养液中迟缓期和对数期时间较短，在较高质量浓度抗生素吸光值增加较快，衰亡期持续时间较长.5种抗生素在不同质量浓度培养液中的生长曲线表明，抗生素是菌株生长的限制因素，抗生素质量浓度增加可刺激菌株生长.

图1 菌株在不同抗生素质量浓度培养液中的生长曲线Fig.1 Growth curves of strains in different antibiotic concentration culture

2.3 培养液抗生素质量浓度变化分析

为进一步求证所分离菌株为以抗生素为单一碳源菌株，将平板上保存的菌株接种到抗生素单一碳源培养液中，研究抗生素质量浓度变化，考虑到抗生素的自身降解同时做空白实验（即不接种菌株）.由图2可知，青霉素和四环素会发生自身降解，培养30 d时，青霉素和四环素的自身降解率分别为22.6%和16.5%.向培养液中接种菌株后，培养液中抗生素的质量浓度显著低于同期对照.其中接种p4培养第30天时，溶液中的青霉素质量浓度比同期空白降低19.5%，通过统计分析差异呈极显著水平（P＜0.01）.同样，接种t5和t9后四环素质量浓度同样比对照显著降低，培养30 d时，溶液中四环素质量浓度比对照分别降低29.1%和24.9%.结果说明分离的菌株利用培养液中抗生素的碳源实现了自身生长.

图2 接种菌株后培养液中抗生素质量浓度变化Fig.2 Antibiotic concentration changes after strains inoculated in medium

2.4 分子生物学鉴定结果分析

从抗性平板上分离得到的5株抗性细菌分别进行总DNA提取、16S r RNA基因扩增，克隆测序后提交GenBank，获得序列号为KF898093、KF898094、KF898095、KF898096、KF898097.应用MEGA 5.0软件采用Neighbor-Joining法Bootstrap为1000构建系统发育树，确定其进化地位（图3）.

从图3可以看出，5种菌株（p4，p5，t1，t5，t9）处于5个不同的分支.p4菌株与1株从根际土壤分离的菌株（SNNU513，JF445288）相似性达到了99%，结合形态观察可初步确定p4菌株属于溶杆菌属（Lysobacter）的产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）.溶杆菌属的微生物为化能异养革兰阴性杆菌，好氧，生长p H范围为5～10，能产水溶性的棕色色素，对几丁质及其他多糖有降解作用［8］.p5菌株与分离自溴苯腈辛酸酯废水处理池1株溴苯腈辛酸酯降解菌株（XB3，HQ845986）相似性为100%，该菌株为争论贪噬菌（Variovorax paradoxus），因此p5属于贪噬菌属（Variovorax），与争论贪噬菌Variovorax paradoxus的亲缘关系较近.Variovorax paradoxus能够分解利用多种有机硫化物、芳香烃、金属离子和其他化合物［18］.

t1与分离自印度水样的Pseudomonas monteilii菌株（PCWCW13，GQ284481）和分离自活性污泥产聚羟基脂肪酸的Pseudomonas taiwanensis菌株（EPAn59，JF911383）相似性同为99%，因此t1菌株大致可确定为假单胞菌属（Pseudomona）.李显志，等［19］对假单胞菌属细菌的研究表明，假单胞菌作为1种机会致病菌，可以介导多种抗生素获得耐药性.同样，DANTAS，等［8］研究分离到的75株以抗生素为单一碳源的抗性菌株中有24%属于假单胞菌属（Pseudomona）.t5与分离自钾质粗面岩的2个Chitinophaga eiseniae菌株（JN251，KF150488）和（JN246，KF150484）相似性同为99%，由此可确定t5属于噬几丁质菌属（Chitinophaga）.t9与1株慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的菌株（PeniS4C4，JQ897948）相似性为99%，可初步确定t9为慢生根瘤菌属（Brad yrhizobium）.可见，分离到的以抗生素为碳源生长的抗性细菌具有群落多样性.

图3 菌株16S r RNA基因的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain 16S r RNA gene sequences

3 结论

通过青霉素或四环素单一碳源选择性培养基（SCS），从未受干扰的森林土壤和长期施有机肥的茶园土壤中共分离出5株生长良好、菌落特征不同的菌株，均为革兰阴性菌.抗生素是抗性菌株生长的限制因素，抗生素质量浓度增加可以刺激菌株生长.分子生物学鉴定结果表明分离的菌株具有群落结构多样性，分别属于溶杆菌属（Lysobacter）、贪噬菌属（Variovorax）、假单胞菌属（Pseudomona）、噬几丁质菌属（Chitinophaga）和慢生根瘤菌属（Brad yrhizobium），这些菌株与一些复杂化合物难降解菌和机会致病菌的系统发育比较接近，应引起重视.

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GU Chao，ZHANG Qichun*，XU Chenguang
（Zhejiang Provincial Key Laboratory of Subtropical Soil and Plant Nutrition/Key Laboratory of Environment Remediation and Ecological Health of the Ministry of Education/College of Environmental and Resource Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

antibiotics；sole carbon source；phylogenetic analysis

S 154

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.03.171

国家自然科学基金（41401266）；浙江省科技厅公益项目（2016C32084）；教育部留学回国人员科研启动基金（教外司留［2014］1685号）.

*通信作者（Corresponding author）:张奇春（http://orcid.org/0000-0002-8984-7413），E-mail:qczhang@zju.edu.cn

联系方式:顾超（http://orcid.org/0000-0002-3370-320X），E-mail:21414101@zju.edu.cn

（Received）:2016 03 17；接受日期（Accepted）:2016 06 06；

日期（Published online）:2016 09 18

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160918.1536.014.html