苦肤洗剂配合红光治疗小鼠变应性接触性皮炎的机理研究＊

方 丽

（山东省泰安市妇幼保健院 泰安 271000）

苦肤洗剂配合红光治疗小鼠变应性接触性皮炎的机理研究＊

方 丽＊＊

（山东省泰安市妇幼保健院 泰安 271000）

目的：观察中药苦肤洗剂联合红光治疗小鼠变应性接触性皮炎（ACD）模型的效果。方法：50只昆明小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、苦肤洗剂组、苦肤洗剂联合红光组、糠酸莫米松软膏联合红光组，每组10只，连续治疗5天。观察小鼠耳变态反应评分，采用流式细胞术、ELISA 分别测定小鼠外周血IFN-γ / IL-4、IFN-γ、IL-4、IL-5数值。病理标本观察过敏反应过程中皮肤组织的病理变化，进行真皮炎性细胞计数。结果：各治疗组均出现变态反应评分下降，小鼠搔抓现象缓解，组织病理显示炎症反应缓解，均能够使IFN-γ / IL-4数值显著提高，并且苦肤洗剂联合红光组促进IFN-γ / IL-4数值显著提高，效果优于苦肤组。外周血相对应的细胞因子IL-4、IL-5含量降低而IFN-γ含量相应升高。结论：苦肤洗剂联合红光组和西药膏联合红光组均能改善小鼠ACD模型耳部炎症反应。但在减轻ACD小鼠模型瘙痒程度上苦肤洗剂联合红光组更为明显。

苦肤洗剂 变应性接触性皮炎 基础研究

目前在湿疹治疗上，无论中医、西医均以对症治疗为主，最常用的是药物外治。西药激素类药膏虽广为应用，但在止痒、减少渗出及对皮损的保护方面远不及中药。对于复杂的湿疹则可以中西医结合，在应用中药的同时，辅以微波、红光等治疗手段。通过照射促进中药的渗透吸收，又能通过红光消炎止痛，提高组织再生修复的速度[1]，提高机体免疫功能[2]达到消炎止痛及修复组织的作用。本研究利用2，4-二硝基氯苯（DNCB）诱导BALB/c小鼠产生变应性接触性皮炎（Allergic Contactdermatitis，ACD）作为模型，观察中药苦肤洗剂配合红光照射对其皮肤损害及对IFN-γ / IL-4的影响，探讨该法治疗湿疹的机制，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级昆明小鼠50只，雌雄各半，7周龄，体质量22-27 g，泰山医学院实验动物中心提供，动物合格证号：鲁动质字140908。饲养于泰山医学院实验动物中心，室内温度20-25℃，湿度40%-60%。适应性喂养3天后进行造模。

1.1.2 主要仪器、试剂及药物

80-2106-20型紫外分光光度仪（英国Pharmacia公司），Ascent酶标仪（芬兰Thermo Labsystems公司），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），半导体激光发光管：电功率58.3 mW，波长650 nm，光斑直径3 mm；照射时间均为5 min，能量密度为61.89 J/cm-2。鼠抗 IL-4-PE、鼠抗CD4-FITC、鼠抗IFN-γ-FITC（美国eBioscience公司）。小鼠IL-4 ELISA试剂盒（美国eBioscience，批号：88-7944），IL-5 ELISA试剂盒（美国eBioscience公司，批号：88-7054），小鼠IFN-γ ELISA试剂盒（批号：EK0375）。2，4-二硝基氯苯（2，4-Dinitrochlorobenzene ，DNCB）（天津市光复精细化工研究所，批号：20120306），丙酮（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20140225）。

所用苦肤洗剂主要成分为苦参30 g、地肤子30 g、野菊花10 g、蒲公英10 g、甘草10 g、蝉蜕6 g、花椒30 g、蛇床子30 g、黄柏15 g、荆芥15 g、防风10 g。应用韩国东华煎药机制成水煎剂400 mL，生药为0.415 g·mL-1放4℃冰箱冷藏备用。以上药物为泰山医学院附属医院中医科制备，批号：20140921。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠ACD模型

参照《药理实验方法学》[3]建立小鼠ACD模型。流程如下：取健康小鼠腹部脱毛，面积约3 cm×3 cm，脱毛后待皮肤干燥后涂1%DNCB丙酮橄榄油溶液100 μL致敏，24 h后重复涂相同剂量强化致敏，再经过72 h后于小鼠双耳内外侧耳面均匀涂以上述溶液20 μL进行激发。于激发后1 h，小鼠耳部开始发红肿胀，同时出现搔抓现象，12 h后耳厚度明显增加，红肿明显，变态反应评分较前明显增加，组织病理学检查显示表皮增厚，细胞水肿明显，大量单核细胞浸润，真皮血管有明显充血，说明小鼠ACD模型造模成功。

根据耳变态反应评分和病理切片判断是否造模成功。正常对照组为同批次小鼠，耳部及腹部仅涂丙酮橄榄油溶液（4：1）作为阴性对照，小鼠耳部皮肤无红肿，偶有搔抓，组织病理学检测表皮层、真皮层无明显异常变化，细胞间偶有单个细胞水肿。

1.2.2 治疗方法

激发成功后12 h开始用药。正常对照组耳廓涂等体积的生理盐水，模型对照组为造模后小鼠耳廓涂等体积生理盐水；苦肤洗剂组为ACD模型小鼠耳廓及腹部涂擦中药洗剂，每日2次，每次100 μL，以玻璃棒反复涂擦内外侧耳面5 s左右，连续5日；苦肤洗剂联合红光组ACD模型小鼠耳廓及腹部涂擦苦肤洗剂，每日2次，每次100 μL，以玻璃棒反复涂擦内外侧耳面5 s左右，涂擦中药10 min后小鼠装入固定器，给予61.89 J·cm-2的红光照射，固定波长650 nm，连续5日。糠酸莫米松软膏联合红光组取适量药膏外涂ACD模型小鼠耳廓及腹部，每日2次，涂擦西药10 min后，红光照射方法同上，每日2次，连续5日。

1.2.3 耳变态反应评价指标

该指标包括小鼠耳变态反应评分和搔抓次数。从抓痕、水肿、红斑3个方面对小鼠双耳变态反应进行评分，取双耳平均值，评分标准参见药理实验方法学[1]。从用药后即开始观察每只小鼠在1 min内搔抓双耳的次数。

1.2.4 采集血清及病理标本

连续用药5天后停药，12 h后摘眼球取血，处死小鼠，取耳部皮损甲醛固定。

1.2.5 流式细胞仪测定

取1 mL眼眶血液，严格按照流式细胞试剂盒要求进行IFN-γ和IL-4检测。

1.2.6 酶联免疫吸附测定

按照各酶联免疫试剂盒要求进行小鼠血清IFN-γ、IL-4及IL-5检测。

1.2.7 组织病理学检测

将切取的耳部皮损做成石蜡切片、HE染色，由病理科两名主任医师分别单独在40×10高倍镜视野下进行真皮淋巴细胞计数，取5个高倍镜视野真皮淋巴细胞数值的平均值。

1.2.8 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行统计，计量资料两样本间比较采用t检验和q检验，多个样本间比较采用方差分析。结果用均数±标准差（-±s）表示。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠用药前后耳变态反应评价

2.1.1 耳变态反应评分

模型对照组得分最高，与苦肤组、苦肤+红外组、西药膏+红外组比较有明显差异（P＜0.01）；苦肤+红光组与西药膏+红光组比较两者无明显差异（P＞ 0.05）。详见表1。

在可持续发展的背景之下，绿色建筑行业前程似锦。为了实现节能减排、环境友好以及安逸舒适的宗旨，有必要进一步对光伏发电系统的组成、设计以及管理展开研究。

2.1.2 搔抓次数上的比较

模型对照组次数最多，与苦肤组、苦肤+红外组、西药膏+红外组、苦肤+西药膏+红外组比较有明显差异（P＜0.01），各治疗组在一定程度上均降低了瘙痒。效果最好的是苦肤+红外组，与西药膏+红外组比较有明显差异（P＜0.05）。 详见表1。

2.2 ELISA法检测各组小鼠IFN-γ、IL-4、IL-5因子

ACD小鼠耳部分别给不同处理后，外周血IFN-γ、IL-4、IL-5水平变化有明显差异，ACD小鼠应用苦肤洗剂后与模型对照组比较，IL-4、IL-5水平降低而IFN-γ水平升高（P＜0.05）。西药膏组+红外组与苦+红外组两两比较未见明显差异，详见表2。

表1 小鼠耳变态反应 评价（±s，n=10）

表1 小鼠耳变态反应 评价（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与西药膏+红光组比较，△P＜0.05。

组别耳变态反应评分搔抓次数/次·min-1正常对照组0.25±0.15 0.80±1.16模型对照组5.40±0.45 22.90±2.23苦 肤组2.40±0.32＃11.45±2.01＃苦 肤+红 光组1.70±0. 16＃#△ 4.37±3.45##△西 药膏+红光组1.60±0.14＃＃ 3.96±2.85##

2.3 小鼠ACD建模用药后外周血炎症因子水平检测流式细胞仪检测

相比模型对照组ACD小鼠耳部分别给不同处理后，苦肤组与模型对照组比较IL-4降低而IFN-γ升高，IFN-γ/IL-4有显著差别，苦肤+红外组，西药膏+红光组与模型对照组也有显著性差别。西药膏+红光组与苦肤+红光组两两比较没有显著差异，详见表3、图1。

2.4 小鼠ACD模型耳部皮肤组织炎症变化

表皮层增厚，细胞内、细胞间轻中度水肿。真皮乳头水肿，可见大量淋巴细胞，伴有肥大细胞和嗜酸性细胞的单核细胞，血管扩张明显，周围可见渗出的红细胞。

ACD小鼠经苦肤洗剂治疗后，耳部皮肤表皮层变薄，细胞内、细胞间水肿减轻，淋巴细胞浸润减少，与模型对照组比有显著差异（P＜0.05）。在淋巴细胞浸润减少程度上，苦肤+红光组与西药膏+红光组比较无明显差异，说明肤洗剂与西药膏在减少淋巴细胞上无差别。详见图2、表4。

表2 ACD建模及用药后外周血炎症因子水平检测/pg·mL-1（±s）

表2 ACD建模及用药后外周血炎症因子水平检测/pg·mL-1（±s）

注：与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组IL-5 IL-4 IFN-γ正常对照组12.37±0.19 9.12±0.23 207.26±0.42模型对照组42.79±0.61 63.26±0.12 126.34±0.17苦肤组32.12±0.74#31.23±0.37#147.27±0.28#苦肤+红光组24.17±0.52##23.57±0.15##162.18±0.24##西药膏+红光组22.82±0.34##21.06±0.19##148.67±0.43#

表3 ACD建模及用药后外周血炎症因子水平检测流式细胞术/%（±s）

表3 ACD建模及用药后外周血炎症因子水平检测流式细胞术/%（±s）

注：与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；西药膏+红光组与苦肤+ 红光组比较，▲P＜0.05。

组别IFN-γ IL-4 IFN-γ/IL-4正常对照组1.81±2.29 2.43±1.59 0.63±3.70模型对照组2.14±1.35 2.03±1.19 1.13±2.90苦肤组3.23±1.29##1.32±9.3##1.87±1.60##苦肤+红外组5.13±2.05##▲0.87±0.23##▲2.17±3.50##▲西药膏+红外组4.83±2.23##0.93±0.12##2.03±2.10##

图1 各组ACD小鼠外周血IFN-γ和IL-4百分率流式图

图2 小鼠ACD模型耳部皮肤组织炎症变化（HE染色，40×10）

3 讨论

湿疹的临床表现以皮肤红斑、丘疹、水疱、糜烂、渗出伴剧烈瘙痒为特征，中医认为其基本病机是湿热毒邪蕴于肌肤，复感风邪，两邪相搏而致皮肤湿疹症状，治疗应以清热解毒、疏风散邪、利湿止痒为主。所用苦肤洗剂中苦参、地肤子、蛇床子、黄柏、荆芥、防风、野菊花、蒲公英、甘草、蝉蜕、花椒诸药合用，共奏清热解毒、疏风散邪、利湿止痒之效。同时配合红光治疗能更好的增强其消炎、止痒、抗过敏的作用。

本研究中，小鼠经1%DNCB腹部致敏和耳部激发后12 h即开始给予不同药物加红光处理后，小鼠过敏症状减轻，搔抓次数减少，组织病理示炎症反应减轻，外周血细胞因子IL-4、IL-5降低而IFN-γ相应升高，IFN-γ/ IL-4增大，证明苦肤洗剂和西药膏联合红光治疗均能改善小鼠ACD模型耳部炎症反应。这与翁晓晨等[11]利用半导体激光照射急性佐剂性关节炎模型的大鼠足三里穴位，可使大鼠TNF-γ与IL-1水平在治疗后显著下降相一致。但在减轻ACD小鼠模型瘙痒程度上苦肤洗剂更为明显，可能的原因为：DNCB致敏的湿疹小鼠经苦肤洗剂治疗后，其免疫失衡状态得到逐步纠正。同时，湿疹过程中常常表现出Th1 / Th2细胞亚群失调。Th2细胞反应释放IL-4、IL-5、IL-10等诱导B细胞产生IgE；Th1细胞活化产生IFN-γ、TNF-β等参与细胞介导的免疫反应。通过观察湿疹小鼠的外周血IL-4、IL-5、IFN-γ，发现小鼠IL-4、 IL-5明显高于正常组，而与IL-4为拮抗因子的IFN-γ则低于正常组，IFN-γ/ IL-4明显增高说明湿疹中Th1 / Th2有失衡存在，这与既往研究相一致[4-10]。

表4 各组ACD小鼠耳组织淋巴细胞计数（±s，n=10）

表4 各组ACD小鼠耳组织淋巴细胞计数（±s，n=10）

注：与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与苦肤+红光组比较，▲P＜0.05。

组别淋巴细胞计数正常对照组 5.3±3.9模型对照组108.3±15.9苦肤组 42.3±15.9##苦肤+红光组 37.7±9.3##▲西药膏+红光组 32.3±11.9##

本实验中，苦肤洗剂联合红光治疗，与单独应用苦肤洗剂相比，表现出更好的抗过敏作用，体现了两者联合的协同作用。在降低ACD模型小鼠变态反应评分、减少皮损内淋巴细胞数量上，苦肤洗剂联合红光疗法与西药膏联合红光疗法，两者疗效无显著性差异苦肤洗剂在变应性接触性皮炎的疗效较优，为本课题组进一步替换激素药膏打下基础。

参考文献

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11 翁晓晨,杨华元.半导体激光照射足三里穴对大鼠急性佐剂性关节炎的生物效应及作用.世界科学技术-中医药现代化, 2014, 16(6): 1287-1293.

Mechanisms of Kufu Lotion and Infrared Laser Therapy for Allergic Contact Dermatitis (ACD) in Mice

Fang Li
(Tai'an Maternal and Child Care Hospital, Tai'an 271000, China)

This study was aimed to observe the effects of Kufu lotion complicated with infrared ray therapy on ACD mice. Fifty mice were randomly divided into five groups: blank control group, model group, Kufu lotion group (Kufu group), Kufu lotion and infrared laser therapy group (Kufu plus infrared laser group), furoic acid betamethasone ointment and infrared laser therapy group (furoic acid plus infrared laser group). After treatments for five days, allergic reaction scores of ear skin, and levels of inflammatory factors such as serum IFN-γ, IL-4 and IL-5 in were tested. Pathological changes of allergic reaction in ear skin were observed, and inflammatory cell count was recorded. It was found that allergy reaction scores of all treatment groups decreased accompanied by the reducing of scratching behavior. Pathological observation showed that the ratio of IFN-γ / IL-4 increased significantly among all treatment groups, which indicated lower inflammatory reaction after treatment. In addition, there were lower levels of IL-4 and IL-5, a higher level of IFN-γ and an increased the ratio of IFN-γ / IL-4 in Kufu plus infrared laser group than those of Kufu group. In conclusion, it was effective in relieving ear inflammatory reaction in ACD mice through both Kufu lotion with infrared laser therapy and furoic acid with infrared laser therapy. Moreover, the former was optimum.

Kufu lotion, allergic contact dermatitis, basic research

10.11842/wst.2016.04.016

R275.9

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2015-08-14

修回日期：2016-02-12

＊ 泰安市科技局科学技术成果鉴定（泰科成鉴字[2014]第111号）：苦肤洗剂联合远红外线治疗小儿湿疹的基础和临床研究。

＊＊ 通讯作者：方丽，主治医师，主要研究方向：皮肤组织病理。