应用ITS2条形码鉴定岭南药材余甘子及其混淆中药品种＊

黄辉庆，黄志海，黄 娟，张 靖，张晓柠，丘小惠＊＊

（1. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510006；2. 国家人类基因组北方研究中心/北京诺赛基因组研究中心有限公司/基因组学研究北京市重点实验室 北京 100176）

应用ITS2条形码鉴定岭南药材余甘子及其混淆中药品种＊

黄辉庆1，黄志海1，黄 娟1，张 靖1，张晓柠2＊＊，丘小惠1＊＊

（1. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510006；2. 国家人类基因组北方研究中心/北京诺赛基因组研究中心有限公司/基因组学研究北京市重点实验室 北京 100176）

目的：本研究应用ITS2序列作为DNA条形码，建立余甘子及其混淆品分子鉴定方法。方法：收集8种共17份余甘子及其混淆品植物样本，提取基因组DNA，扩增ITS2基因并双向测序。所得序列采用Codon Code Aligner进行拼接，同时，从GenBank数据库中获3条相关ITS2序列用于比较分析。利用MEGA 6.06软件分析其种内及种间遗传距离，并构建系统进化树。结果：余甘子ITS2序列长度为208 bp，与其他各物种种间变异位点较多，遗传距离较大，为0.174-0.823。聚类树结果显示，余甘子基原植物独聚一支，与其他混淆品能够容易区分。结论：本研究采用ITS2序列能够有效鉴别余甘子及其混淆品基原植物，可为保证临床用药真实安全提供技术支撑。

余甘子 ITS2序列 分子鉴定 DNA条形码

大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblica Linn.具有重要的药用价值，其果实为中药余甘子，收录于2015版《中国药典》一部，药食兼用，具清热凉血、消食健胃、生津止咳的功效。余甘子树皮以“紫荆皮”之名收录于《北京市中药饮片炮制规范》2008版等地方标准，部分研究者认为其为紫荆皮的正品[1,2]。然而，由于历史和地区习俗等多种原因，历代草本和各地方标准对紫荆皮的基原植物记载均不相同，存在严重的“一名多药”现象，给监管带来难题，如：《全国中药炮制规范》收载的紫荆皮来源为豆科植物紫荆Cercis chinensis Bunge，《上海市中药饮片炮制规范》2008版收载紫金皮的来源为木兰科植物南五味子Kadsura longipedunculata的干燥根皮，两者常难以分辨[3]。此外，还有卫矛科植物昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum Hutch（《滇南本草》）的根皮、桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus的干燥树皮等多种植物来源[4]。

DNA条形码鉴定技术基于遗传信息的鉴定方法，具有鉴定准确快速、不受研究对象外部形态干扰等特点，尤其适合以部位入药中药材的真伪鉴定[5]。其中ITS2条形码在中草药鉴定应用中非常广泛，Chen等[6]对753个属4 800个种内的6 600个药用植物样本进行研究，结果发现ITS2在物种水平的鉴定效率达到92.7%，故推荐其作为药用植物的标准条形码。Luo等[7]以芸香科72属192种300个样本为研究对象，通过候选条形码（matK、rbcL、psbA-trnH、rpoC1、ycf5、ITS2、ITS）的对比筛选研究，发现ITS2条形码在所考察的序列中具有最高的物种鉴定成功率。基于前期研究，本文将探讨应用ITS2条形码技术鉴别余甘子及其同属药用植物及紫荆皮混伪品的DNA鉴定方法，为保证紫荆皮、余甘子等中药材的质量提供依据。

1 材料和方法

1.1 药材

本研究共收集余甘子P. emblica及其市场常见混淆品紫荆C .chinensis、南五味子K. longipedunculata、昆明山海棠T. hypoglaucum、紫薇Lagerstroemia indica L.、叶下珠Phyllanthus urinaria L.、小果叶下珠Phyllanthus reticulatus Poir. 9个物种共20个样本。其中17个样本为实地采集，材料由广东省中医院黄志海主任药师鉴定，凭证标本已保存于广东省中医院。此外，从GenBank数据库中获3条完整的ITS2序列，验证后用于比较分析。具体信息见表1。

1.2 试剂和仪器

植物基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：P4104）；2×Taq PCR Mix 酶（北京艾德莱生物科技有限公司，批号：262451AX）；D2000 DNA Marker（日本TaKaRa 公司，批号：P4219）；Glodview核酸染料（上海赛百盛基因技术有限公司，批号：20151209）；β-巯基乙醇（美国sigma公司，批号：M6250）；Tris（美国sigma公司，批号：V900483）；Tris-HCl（上海麦克林生化科技有限公司，批号：T818979）；琼脂（美国sigma公司，批号：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，其余试剂均为分析纯。

PCR system（美国Life Technologies公司，型号：ProFlex）；水平电泳槽（美国Bio-Rad公司，型号：Mini-Sub Cell GT）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：GelDoc XR+）；小型离心机（德国eppendorf公司，型号：5418）；多功能样品均质器（法国Bertin Technologies，型号：Precellys 24）；多功能垂直旋转混合器（英国Grant公司，型号：PTR-30/PTR-60）。

表1 余甘子及其混淆品的样本信息

1.3 方法

选取低温干燥的植物叶片30 mg或根皮40 mg左右，磨碎后采用天根植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA，方法依照说明书。PCR扩增选用通用引物，ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。PCR反应体系为25 μL，包含：上下游引物各1 μL（2.5 μmol·L-1）、2×Taq PCR Mix酶12.5 μL、总DNA 2.0 μL、dd H2O 8.5 μL。扩增程序：94℃、5 min；94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环；72℃、10 min[12]。PCR扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳条带明亮、单一、清晰的PCR产物送至上海美吉生物有限公司广州办事处完成测序。

1.4 数据分析

所得峰图利用CodonCode Alinger 6.02软件进行校对拼接，基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除5.8S和28S区段，获得ITS2序列[8]。将所得序列采用软件MEGA 6.06进行分析比对，基于K2P模型进行种内种间遗传距离分析，并用邻接法（Neighbour-Joining，NJ）及最大似然法（Maximum Likehihood，ML）构建系统发育NJ树及ML树[9,10]，同时以bootstrap支持率1 000次重复检验各分支的支持率。

2 结果

2.1 ITS2序列变异分析

余甘子序列长度均为208 bp，比对后发现种内无变异位点，GC含量为54%。将余甘子与其混伪品紫荆、南五味子、昆明山海棠及紫薇比对后发现，不同品种间存在较多变异位点，分别为80、90、80及85个变异位点；同时该物种与其同属植物蜜甘草、浙江叶下珠、叶下珠及小果叶下珠之间也存在明显差异，分别有60、63、36及42个变异位点。其余物种种内比对后发现：南五味子序列长度为231 bp，有2个变异位点，分别为99、177位T/C突变；昆明山海棠序列长度均为230 bp，种内存在1个变异位点，为80位C/T突变；小果叶下珠序列长度为208 bp，种内均存在2个变异位点，分别为35位A/C 突变、144位C/G突变；叶下珠种内暂未发现变异位点。由此可见，余甘子及其混淆品种间变异位点明显多于种内变异位点，能够较好地区分。

表2 余甘子及其混淆品种间遗传距离

2.2 遗传距离分析

基于K2P模型分析得到各物种种内及种间遗传距离。结果显示，余甘子种内遗传距离为0，其余物种种内遗传距离均不超过0.013。种间遗传距离较大，余甘子与其混淆品之间种间距离在0.174-0.823之间，具体各物种间K2P距离见表2。

2.3 聚类树分析

为确定ITS2序列在余甘子与其混淆品之间的鉴定能力，本研究采用邻接法及最大似然法分别构建NJ树和ML树，同时去除bootstrap支持率小于50%的分支，聚类树见图1和图2。分析显示，两种聚类树结果基本一致。余甘子与叶下珠亲缘关系最近，但两者之间NJ树支持率为84.0%，ML树支持率为65.0%，可将两者进行很好的区分。同属植物余甘子、叶下珠、蜜甘草、浙江叶下珠及小果叶下珠聚为一大支，符合植物分类学特点。同时，各物种种内样本分别聚在一支，表现出单系性，与其他品种能够明显区分。

图1 基于ITS2序列的余甘子与其混淆品NJ树

图2 基于ITS2序列的余甘子与其混淆品ML树

3 讨论

根据调研，多数人认为正品紫荆皮来源为大戟科植物余甘子的干燥树皮[2]，为骨伤科和妇科常用药材，具有消肿解毒、收敛止血、杀菌祛腐的作用；用于痈肿、阴囊湿疹、外伤出血、跌打损伤、蛇虫咬伤。临床使用的紫荆皮伪品主要来源于豆科植物紫荆的干燥树皮及木兰科植物南五味子的干燥树皮。由于“紫荆皮”未被《中国药典》收录，该药材品种混乱，甚至在研究文献中来源也不尽相同[11-13]。由于3种植物来源于不同种属，药理作用及化学成分存在一定的差异[4,11]，在临床上不宜混用。由于地方习俗和标准记载不一致，各地使用的紫荆皮来源于不同基原植物，容易引起用药混乱，导致临床疗效不确切。

传统鉴别专业性强，尤其是一些外观形态较为相似或深加工饮片，通常无法进行快速鉴定。本实验基于ITS2序列建立了一种快速鉴定余甘子及其他紫荆皮基原植物的方法。分析发现，余甘子及其混淆品种内变异位点较少（为0-2个），而种间均有几十个变异位点，且物种内最大遗传距离（0.013）远小于种间最小遗传距离（0.173），存在明显的条形码间隔；NJ及ML进化树图结果显示，各物种单独成支。以上结果均说明，利用ITS2片段可迅速将余甘子及其混淆品区分开来。同时，结果显示，物种ITS2序列非常稳定，如余甘子长度均为208 bp、紫荆长度为216 bp、南五味子序列长度为231 bp，昆明山海棠长度为230 bp，表明ITS2序列适用于余甘子与其混淆品的鉴定。

本研究首次将临床常用紫荆皮的3种基原植物进行ITS2序列分析，说明采用分子鉴定技术易将这3种混用品区分开来。笔者认为，针对现在市场及临床使用紫荆皮药材混乱现象，监管部门应制定统一标准，规范该药的来源，同时更正其它以紫荆为皮名的药材。结合传统鉴定技术及DNA分子鉴定手段，从源头保证药材来源的准确性，杜绝临床同名异药现象。

1 高婷,朱珣之,宋经元.有毒中药土荆皮的ITS2条形码序列分析鉴定.世界科学技术-中医药现代化, 2013, 15(3): 387-392.

2 崔国静,石思佳,宋桂英.紫荆皮与混乱品的鉴别.首都医药, 2010, 23: 43.

3 周胜建,祝庆明.紫荆皮的本草学考辨.时珍国医国药, 2005, 16(3): 265-266.

4 程小丽,廖彩丽,刘春生,等.基于NCBI核酸数据库的紫荆皮混淆品种华中五味子的DNA鉴定研究.中国中药杂志, 2012, 37(17): 2534-2537.

5 费希同,巨苗苗,林源,等. ITS2序列在植物DNA条形码鉴定中的应用.亚热带植物科学, 2014, 43(4): 339-342.

6 Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One, 2010, 5(1): e8613.

7 Luo K, Chen S L, Chen K L, et al. Assessment of candidate plant DNA barcodes using the Rutaceae family. Sci China Life Sci, 2010, 53(6):701-708.

8 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430 (1-2): 50-57.

9 Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very larger phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (30): 11030-11035.

10 Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihyood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739.

11 卢珑,沈丽,王雪妮,等.紫荆皮、紫金皮、昆明山海棠镇痛作用比较研究.天津中医药大学学报, 2012, 31(3): 163-165.

Molecular Identification of Phyllanthus emblica and Their Adulterants via DNA Barcode

Huang Huiqing1, Huang Zhihai1, Huang Juan1, Zhang Jing1, Zhang Xiaoning2, Qiu Xiaohui1
(1. The 2ndClinical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Chinese National Human Genome Center, Beijing / SinoGenoMax Co., Ltd / Beijing Key Laboratory of Genomics, Beijing 100176, China)

In order to guarantee the species correction of Phyllanthus emblica, a molecular identification method taken ITS2 as DNA barcode has been verified. Samples from P. emblica and its adulterants were collected, and their ITS2 regions were amplified and sequenced. Sequences were then assembled by CodonCode Aligner and analyzed with MEGA 6.06. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were computed and the phylogenetic tree was built using the neighbor-joining (NJ) and maximum likelihood (ML) trees. It was found that the length of ITS2 sequence of P. emblica was 208 bp. The K2P distance of the inter-specific samples between P. emblica and its adulterants ranged from 0.174 to 0.823. The phylogenetic tree indicated that P. emblica and its adulterants could be distinguished clearly. In conclusion, it was demonstrated that the ITS2 sequence was convevient for uncovering the molecular evidence behind the identification of P. emblica and its adulterants, and provided a fundation for identifying the original plants, which secured the safety and effectiveness of clinical medication.

Phyllanthus emblica, ITS2, molecular identification, adulterants, DNA barcode

10.11842/wst.2016.08.029

R282

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-07-28

修回日期：2016-08-10

＊ 广东省中医院院内专项（2015KT1817）：岭南中草药DNA条形码分子鉴定和生态适宜性研究，负责人：黄志海。

＊＊ 通讯作者：张晓柠，助理研究员，主要研究方向：分子生物学研究；丘小惠，研究员，主要研究方向：中药质量标准及物质基础研究。