中药复方“金复康”抑制肺癌细胞生长机制的研究＊

陈 健，康亚妮＊＊，沈挺挺，赵小东，付艳丽，许 玲

（1.上海交通大学生物医学工程学院/上海系统生物医学研究中心 上海 200240；2.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

中药复方“金复康”抑制肺癌细胞生长机制的研究＊

陈 健1，康亚妮1＊＊，沈挺挺1，赵小东1，付艳丽2，许 玲2

（1.上海交通大学生物医学工程学院/上海系统生物医学研究中心 上海 200240；2.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

目的：本文主要探讨中药复方金复康萃取物对人非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）A549细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法：本文以人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象，应用CCK8试剂盒检测了金复康萃取物对细胞增殖活力的影响，流式细胞技术检测金复康对细胞凋亡诱导作用，实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（Real-time qPCR，RT-qPCR）检测细胞凋亡相关基因的表达。结果：金复康萃取物对A549细胞增殖有较显著抑制作用，并且存在剂量依赖效应。与对照组相比，金复康处理组细胞数量明显减少，伴随着大量细胞间距增大，失去原有形态，DAPI细胞核染色结果显示细胞核受到损伤。流式细胞检测实验显示金复康明显诱导A549细胞凋亡。RT-qPCR检测发现金复康上调凋亡相关基因转录表达水平。结论：金复康通过诱导细胞凋亡抑制A549细胞增殖，这一过程可能与其诱导凋亡相关基因FADD和GADD45a表达上调有关。

肺癌 金复康 细胞凋亡 FADD基因 GADD45a基因

肺癌是当今世界发病率和致死率最高的一类恶性肿瘤[1]。工业化速度加快，环境污染加重和人口老龄化加剧等原因导致肺癌发病率和死亡率呈现出明显上升趋势[2]。目前对于肺癌的治疗，临床一般采取手术、化疗、放疗、分子靶向治疗等手段[3]。临床治疗虽然可以增加患者的存活率且延长存活期，但由于化疗、放疗等对人体伤害较大，也带来了一些令人困扰的不良反应[4]。许多中药复方通过其多途径、多靶点的综合作用，在减轻其他治疗不良反应的同时，还可改善肺癌患者症状，提高生活质量并延长生存期。因此，目前认为很多中草药是很有潜力的生物药物应用于癌症治疗[5]。金复康是国家三类治疗肺癌的中成药，在临床中应用较广，已被国家食品药品监督管理总局批准的口服抗非小细胞肺癌药物[6]。它作为一类黄芪为主的中药复方，已有报道可以提高非小细胞肺癌患者的化疗效果[7]，并且可以在小鼠体内抑制癌细胞的生长，但是其分子作用机制尚不十分明确。

本研究通过不同浓度金复康醇取物作用于肺癌细胞系A549，深入探讨金复康抗肿瘤作用机制，从细胞形态学和分子水平检测了金复康抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，发现这些作用可能是由金复康诱导的凋亡相关基因FADD和GADD45a的表达所引起。这些研究为治疗肺癌新型药物的研制开发提供了新思路，丰富了中医药扶正抗癌的理论，为中国传统中医药进一步用于肿瘤的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系A549由上海中医药大学附属龙华医院许玲教授课题组惠赠，培养于RPMI-1640培养基。将A549细胞系置于37℃，5% CO2饱和湿度培养箱无菌培养。

1.2 金复康醇提物的制备

金复康醇提物由华东理工大学金郁教授课题组惠赠。金复康按表1称量，70%乙醇200 mL, 80℃回流提取1 h。70%乙醇定容到200 mL；采用0.22 μm滤膜过滤，分装后4℃密封保存。

1.3 主要仪器与试剂

倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo公司），NanoDrop 2000（美国Thermo公司）；T100-PCR仪（美国Bio-Rad公司）；ABI Step One Real-time PCR仪（美国ABI公司）；生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Cell Counting Kit 8（日本同仁化学研究所）；Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒（北京庄盟国际生物科技有限公司）；TRIzolReagent，SuperScript III Reverse Transcriptase，UltraPureTMDNase/RNase-Free Distilled Water（美国Life-Invitrogen公司）；RNasin Ribonuclease Inhibitor（美国Promega公司）；SYBR Green PCR Master Mix（德国Bestar公司）。

表1 金复康组成成分

1.4 实验方法

1.4.1 CCK8检测细胞增殖抑制作用

取对数生长期的A549细胞，以2×103个/孔接种于96孔板，每孔加入200 μL培养基，细胞贴壁后吸尽原培养基，加入含不同浓度（0、0.04、0.05、0.08、0.10 mg·mL-1）的金复康药物200 μL，每组设3个平行复孔，0 mg·mL-1设为对照组，另设与实验组平行但只加培养基不加细胞的空白对照组，培养48 h。弃掉培养基，加入100 μL检测液（CCK8工作液：培养基=1：10），37℃避光孵育3 h。震荡混匀，用全自动酶标仪在波长450 nm下测定各孔吸光值A。数据处理，以细胞增殖抑制率公式计算实验组细胞生长率，确定IC50浓度。细胞生长率计算公式：抑制率/% =（对照组A450值-实验组A450值）/（对照组A450值-空白对照A450值）×100%

1.4.2 细胞形态学变化与DAPI染色

细胞爬片：取对数生长期A549细胞，以1×105个/孔，接种于放有清洁无菌的载玻片的6孔板，培养24 h后，分别用0 mg·mL-1和IC50浓度金复康作用细胞48 h。光学显微镜下观察0 mg·mL-1和IC50浓度作用后细胞状态变化。DAPI染色观察DNA损伤：各组细胞用PBS清洗3遍，用适量4%多聚甲醛固定细胞30 min后，加入1 μg·mL-1DAPI染色液室温避光孵育10 min。在倒置荧光显微镜下观察DNA完整性。

1.4.3 AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

细胞凋亡形态学检测：以1×105个/孔的浓度将对数生长期A549细胞，接种于放有清洁无菌载玻片的6孔板，待细胞贴壁后，分别用0 mg·mL-1和IC50浓度金复康处理细胞。药物作用48 h后，PBS清洗玻片，每孔加入含有5 mL Annexin V-FITC染色液和10 mL PI染色液的Binding Buffer 500 μL，室温避光孵育15 min后，倒置荧光显微镜下观察细胞状态。流式细胞技术检测细胞凋亡率：不同浓度金复康（0、0.04、0.05 mg·mL-1）作用细胞48 h后，用不含EDTA的0.25%胰蛋酶消化细胞，培养基重悬细胞，1 000 r·min-1离心5 min，预冷PBS清洗2遍，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，避光加入5 mL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，用细胞筛将细胞混悬液过滤至5 mL流式检测管，流式检测，同时使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重迭和设定十字门的位置。

1.4.4 Real-time PCR检测与细胞周期和凋亡相关基因表达

TRIzol试剂直接提取金复康（0、0.05 mg·mL-1）处理后的A549细胞总RNA，Nanodrop 2000核酸定量仪检测RNA浓度和纯度。取各实验组1 μg总RNA，按照Superscript IIIReverse Transcriptase说明书反转录为cDNA。Real-time qPCR检测FADD和GADD45a基因表达，扩增引物序列如下：GADD45a-F：CTGGAGAGCAGAAGACCGAA，G A D D 4 5 a-R：A C C C C G A C A G T G A T C G T G；FADD-F：CTGGGGAAGAAGACCTGTGT，FADD-R：CTGACGAGCCAGCCTTC TC。PCR反应：SYBR Green PCR Master Mix（2×）5 μL；Forward Primer（10 μM）0.4 μL；Reverse Primer （10 μM）0.4 μL；cDNA 2 μL；补水至10 μL。PCR扩增：95℃，2 min；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，30 s。使用ABI Step One仪器及软件分析各目的基因表达情况。

1.4.5 统计学分析

用SPSS 19.0进行统计学分析，实验结果差异分析采用Student t检验，P＜0.05时对比组之间的差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 金复康对细胞增殖的抑制作用

不同浓度金复康萃取物处理A549细胞48 h后，用Cell Counting Kit 8检测细胞活力。结果显示，金复康对A549细胞增殖有明显抑制作用，并且随着浓度的增大，抑制作用越明显。当药物浓度分别为0.04、0.05、0.08 mg·mL-1时，细胞活力分别是61%、44%和41%。金复康的半数抑制浓度约为0.05 mg·mL-1（图1）。

2.2 金复康引起A549细胞形态学变化与DNA损伤

与对照组细胞相比，金复康处理组细胞数量明显减少，而且伴随着细胞间距增大，失去原有形态（图2A）。DAPI染色结果显示细胞核受到损伤（图2B）。此结果表明金复康抑制细胞增殖，这种抑制作用可能与引起细胞染色体损伤有关。

2.3 金复康诱导A549细胞凋亡

为了确定A549细胞凋亡与金复康诱导的细胞死亡之间的关联，本文用倒置荧光显微镜检测了A549细胞的形态学变化（图3A）。同时用AnnexinV-FITC和PI对细胞进行染色分辨正常细胞和凋亡细胞。凋亡细胞的细胞膜蛋白磷酯酰丝氨酸会外翻到膜外，可与AnnexinV结合进而被FITC染成绿色，而细胞核则会被PI染成红色。如图3A所示，凋亡细胞的细胞膜被AnnexinV-FITC染成绿色，细胞核被PI染成红色，而正常细胞则没有被染上色。进一步采用流式细胞技术检测细胞凋亡率（图3B），发现0.04 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1的金复康处理细胞后，细胞凋亡率分别是10.2%和39.9%，而正常细胞为4.2%。此结果说明金复康明显诱导了A549细胞凋亡。

图1 金复康对A549细胞增殖抑制作用

图2 金复康处理A549后细胞形态变化和DNA损伤

图3 金复康诱导A549细胞凋亡

图4 金复康诱导FADD和GADD45a表达上调

2.4 金复康调节与细胞凋亡相关基因的mRNA水平表达

为了进一步阐明金复康诱导A549细胞凋亡的分子调控机制，本文用Real-time PCR检测了凋亡相关基因的mRNA表达水平（图4）。结果发现与凋亡相关重要基因FADD和GADD45a的表达均上调。

3 讨论

自然界多细胞有机体中都存在细胞增殖与死亡的平衡稳态。二者的失衡往往会导致很多疾病。肿瘤的一个明显特征就是可以肿瘤细胞无限增殖。中医理论认为癌症可能是由于机体阴阳失衡导致[8]。细胞增殖与死亡正类似于中医的阴阳消长，这种阴阳消长平衡被打破是导致癌症发生的原因之一。细胞凋亡是正常细胞死亡的重要途径之一，但是在很多肿瘤组织中，细胞凋亡往往会失去控制，肺癌的发生发展也与细胞凋亡失控密切相关[9]。

金复康是上海中医药大学附属龙华医院教授刘嘉湘先生，以扶正祛邪思想为指导，历经30多年临床研究总结的中药复方。针对肺癌患者多有气阴两虚的特点，金复康精选了益气养阴，补肾培本等扶正中药为主，佐以清热解毒功用中药组成配伍方药[10]。金复康在控瘤和提高患者生存质量等方面具有较好疗效。本文从诱导细胞凋亡方面研究了金复康的作用机制。

参与细胞凋亡调控的蛋白有很多，Fas相关死亡结构域蛋白（Fas Associated Death Domain，FADD）是死亡受体途径中重要的一类转接蛋白，它可以将Fas/FasL结合后的凋亡信号传导到下游蛋白，激活Caspase8并导致下游Caspase3和Caspase6级联反应，从而引起细胞凋亡[11]。Shin等[12]发现在大多数非小细胞肺癌中均有FADD的表达。杨超等[13]报道FADD的表达水平与非小细胞肺癌的恶性程度有一定关系，恶性程度越高，对应FADD表达水平越低。杨琴等[14]发现FADD在非小细胞肺癌中的表达程度与癌细胞凋亡呈现明显的正相关。杨仁荣等[15]的研究发现在NSCLC组织中癌细胞凋亡与Fas/FasL的表达不具相关性。可以推测，非小细胞肺癌中FADD介导的细胞凋亡可能存在不依赖Fas/FasL的其他通路。另外，FADD不仅与细胞凋亡相关，还可能参与细胞周期调控，控制细胞增殖[16]。因此，FADD与细胞凋亡的关系十分密切。

1988年Fomace等发现基因GADD45a，其为生长阻滞和DNA损伤基因[17]。当细胞受到外界因素损伤时，GADD45a被诱导高表达，调控细胞周期阻滞于G2/M期[18]。GADD45a的诱导表达还可以通过上调P21、P27、P57等DNA损伤修复有关基因，活化P38和JNK通路有效促进细胞凋亡[19]。GADD45a还可诱发细胞骨架稳定性降低，致使淋巴细胞瘤-2相互作用的细胞凋亡调节因子（Bcl-2 Interacting Mediator of Cell Death，Bim）蛋白从细胞骨架解离和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 Assaciated X protein，Bax）寡聚体的形成，导致细胞色素c由线粒体进入胞浆，促进凋亡的形成[20]。GADD45a作为生长周期阻滞和DNA损伤调节机制中的重要基因，在维持基因组稳定、抑制肿瘤的发生、诱导凋亡等生物学过程中起着十分重要的作用。

本文CCK8结果显示，金复康对A549细胞增殖有明显抑制作用，并且随着浓度的增大，抑制作用越明显。DAPI细胞核染色实验表明金复康抑制细胞增殖作用可能与引起细胞染色体损伤有关。AnnexinV-FITC和PI双染实验对细胞凋亡进行了定性检测，并进一步采用流式细胞技术检测细胞凋亡率，发现金复康明显诱导了A549细胞凋亡。为了进一步阐明具体的分子调控机制，本文用Real-time PCR检测了凋亡相关基因的mRNA表达水平。结果发现与凋亡相关重要基因FADD和GADD45a的表达均上调，表明金复康可通过FADD和GADD45a介导的细胞凋亡途径来达到抗肿瘤的作用。

综上所述，本实验证明金复康醇提物可以诱导肺癌A549细胞的凋亡，这种凋亡作用是通过激活FADD和GADD45a介导的细胞凋亡途径完成的。本研究为中医药治疗肺癌提供了可靠的实验依据和一定的理论支持。

1 Li C, Hong W. Research status and funding trends of lung cancer biomarkers. J Thorac Dis, 2013, 5(5): 698.

2 姚晓军,刘伦旭.肺癌的流行病学及治疗现状.现代肿瘤医学,2014,22(8):1982-1986.

3 李昊,钟理,丁浩,等.肺癌个体化治疗的现状及展望.临床与实验病理学杂志,2014,30(2):196-199.

4 陈海英,金学娣,陈丽萍.肺癌患者生活质量现状及影响因素分析.护理学报,2009,16(7):26-28.

5 Chang H C, Chang F R, Wu Y C, et al. Anti-cancer effect of liriodenine on human lung cancer cells. Kaohsiung J Med Sci, 2004, 20(8): 365-371.

6 Cassileth B R, Rizvi N, Deng G, et al. Safety and pharmacokinetic trial of docetaxel plus an Astragalus-based herbal formula for non-small cell lung cancer patients. Cancer Chemother Pharmacol, 2009, 65(1): 67-71.

7 Liu J X, Shi Z M, Li H G, et al. Clinical observation on 271 cases ofnon-Small cell lung cancer treated with yifei kangliu yin. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2001, 7(4): 247-250.

8 颜兵,魏品康.中医阴阳动态失衡与肿瘤的关系.江苏中医药,2011,43(6):5-8.

9 Shivapurkar N, Reddy J, Chaudhary P M, et al. Apoptosis and lung cancer: a review. J Cell Biochem, 2003, 88(5): 885-898.

10 刘嘉湘.金复康口服液治疗肺癌的研究.首届国际中西医肿瘤研究论坛论文专辑,2008.

11 Muzio M, Chinnaiyan A M, Kischkel F C, et al. FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3–like protease, is recruited to the CD95 (Fas/APO-1) death-inducing signaling complex. Cell, 1996, 85(6): 817-827.

12 Shin M S, Kim H S, Lee S H, et al. Alterations of Fas-pathway genes associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer. Oncogene, 2002, 21(26): 4129-4136.

13 杨超,蒋军广,翟建霞,等. FADD在非小细胞肺癌组织中的表达及与癌细胞凋亡的关系.中国老年学杂志,2013,33(8):1772-1773.

14 杨琴,朱润庆,方忠,等.非小细胞肺癌组织中FADD基因的表达及突变分析.癌症,2005,24(3):321-326.

15 杨仁荣,周燕.肺癌组织中Fas、FasL表达与凋亡的关系及其意义.癌症,2002,21(1):101-102.

16 Papoff G, Trivieri N, Crielesi R, et al. FADD–calmodulin interaction: A novel player in cell cycle regulation. Biochim Biophys Acta, 2010, 1803(8): 898-911.

17 Hollander M C, Fornace Jr A. Genomic instability, centrosome amplification, cell cycle checkpoints and Gadd45a. Oncogene, 2002, 21(40): 6228-6233.

18 Zhu N, Shao Y, Xu L, et al. Gadd45-α and Gadd45-γ utilize p38 and JNK signaling pathways to induce cell cycle G2/M arrest in Hep-G2 hepatoma cells. Mol Biol Rep, 2009, 36(8): 2075-2085.

19 Hildesheim J, Belova G I, Tyner S D, et al. Gadd45a regulates matrix metalloproteinases by suppressing ΔNp63α and β-catenin via p38 MAP kinase and APC complex activation. Oncogene, 2003, 23(10): 1829-1837.

20 Tong T, Ji J, Jin S, et al. Gadd45a expression induces Bim dissociation from the cytoskeleton and translocation to mitochondria. Mol Cell Biol, 2005, 25(11): 4488-4500.

A Study on the Mechanism Behind the Growth Inhibition of Human Lung Cancer Cells Induced by Chinese Herbal Compound Jin Fu Kang (JFK)

Chen Jian1, Kang Yani1, Shen Tingting1, Zhao Xiaodong1, Fu Yanli2, Xu Ling2
(1. School of Biomedical Engineering, Bio-ID Research Center, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China;
2. Tumor Institute of Traditional Chinese Medicine, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China)

The aim of the study was to explore the effects of JFK on the proliferation and apoptosis of human nonsmall cell lung cancer (NSCLC), A549 cells, and its mechanism. In this study, we investigated the anticancer activity and the underlying mechanism of JFK extract on A549 cells. Cell viability analysis was detected using Cell Counting Kit 8 (CCK8), while cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The genetic expressions involved in the apoptosis were quantified using RT-qPCR. As a result, JFK extract inhibited the proliferation of A549 cells in a dose-dependent manner. Compared with untreated cells, the number of living cells administered with JFK extract was significantly decreased, while numerous cells were enlarged and became flat. DAPI staining results indicated that nuclear damage of A549 cells were induced by JFK extract. Flow cytometry assay showed that apoptosis occurred in A549 cells after the administration of JFK extract. It was found that the levels of apoptosis associated genes were up-regulated detected by real-time qPCR. In conclusion, it was demonstrated that JFK extract inhibited the proliferation of lung cancer cell by means of cell apoptosis which could be involved in the up-regulation of FADD and GADD45a, the apoptosis associated genes.

Lung cancer, Jin Fu Kang, cell apoptosis, FADD gene, GADD45a gene

10.11842/wst.2016.10.024

R285

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2014-12-23

修回日期：2014-12-29

＊ 国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题（JDZX2012123）：基于转录调控网络分析的中药复方作用机理的研究，主持人：赵小东；上海龙华医院国家中医临床研究基地“龙医团队、龙医学者”项目（LYTD-21）：以转录调控网络为表征参数的金复康作用机理研究，主持人：赵小东；上海交大-SMC晨星青年学者奖励计划（15X100090011）：肿瘤发生发展的机制，主持人：康亚妮。

＊＊ 通讯作者：康亚妮，讲师，主要研究方向：从事中药抗肿瘤活性及其机制研究。