基于代谢调控通路的京尼平苷干预阳黄证的作用靶标研究＊

方 衡，张爱华，周小航，于静波，王 亮，刘 畅，宋 琦，王喜军

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

基于代谢调控通路的京尼平苷干预阳黄证的作用靶标研究＊

方 衡，张爱华，周小航，于静波，王 亮，刘 畅，宋 琦，王喜军＊＊

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

目的：基于代谢调控通路技术对京尼平苷干预阳黄证小鼠进行研究，探究阳黄证的发病机制及京尼平苷对其干预作用的潜在效应靶标。方法：采用化学物质、中药及病理性肝损伤因素建立阳黄证动物模型，通过与临床阳黄证患者尿液的生物标记物相关联，成功建立阳黄证动物模型。在此基础上对生化指标、病理观察进行检测，基于代谢组学技术挖掘京尼平苷干预阳黄证的作用靶标。结果：与空白组相比，模型组小鼠谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总胆红素、总胆汁酸含量升高，具有显著性差异（P＜0.05）。碱性磷酸酶、直接胆红素、丙二醛、谷氨酰转肽酶含量升高，谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶含量降低；病理结果显示，模型组小鼠肝组织成片状坏死，肝细胞有水肿现象。对模型组小鼠尿液进行基于代谢调控的靶点分析，发现33个尿液生物标记物与阳黄证的发生密切相关。其中，10个生物标记物与临床阳黄证患者生物标记物变化一致，主要涉及酪氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、谷胱甘肽代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯代谢、初级胆汁酸代谢等。进一步通过Ingenuity Pathway Analysis组学数据分析平台成功预测京尼平苷干预阳黄证的5个作用靶点，即干扰素调节因子3、鸟氨酸脱羧酶抗酶1（OAZ1）、鸟氨酸脱羧酶1（ODC1）、解偶联蛋白（UCP1）、Maf1调节剂（Maf1 regulator）。结论：本研究以中医证候理论为指导，在对阳黄证形成本质考察的基础上，以中药与肝损伤化学诱导剂结合的方法建立阳黄证动物模型，与临床黄疸生物标记物相关联，发现10个生物标记物与阳黄证发生发展密切相关，京尼平苷可有效回调生物标记物，通过代谢调控通路技术分析发现京尼平苷干预阳黄证的5个潜在作用靶标。本研究为阳黄证相关动物模型建立及中药有效成分治疗作用机制研究提供方法和依据。

代谢组学 京尼平苷 阳黄证 生物标记物 作用靶点

代谢组学是一门新兴的组学技术，采用高通量的检测技术对生物系统内所有小分子代谢产物进行非靶向性的全面分析，通过模式识别、专家系统、数据库检索等手段筛选并鉴定与疾病发生、发展密切相关的生物标记物。这些具有代表性的小分子代谢产物可以用于临床疾病的诊断，且生物标记物涉及到的代谢通路可能为阐明发病机制及药物作用靶点提供有力依据。此外，代谢组学与中医药的整体观理论具有高度一致性，被广泛应用于阐明症候的发病机制和方剂的药效研究。

阳黄属湿热黄疸，黄疸首见于《内经》，依据患者的精神和食欲状态，将黄疸分为黄疸和胃疸，指出目黄、身黄、小便黄为黄疸病的三大主要临床症状，为后世认识黄疸奠定了基础。东汉医家张仲景所著《伤寒杂病论》和《金匮要略》对阳黄证有比较详细的论述。如《伤寒论》236条：“阳明病，发热汗出者，此为热越，不能发黄也；但头汗出，身无汗，剂颈而还，小便不利，渴饮水浆者，此为瘀热在里，身必发黄，茵陈蒿汤主之”。元·罗天益《卫生宝鉴·发黄》中指出：“中阳偏盛，湿从热化，湿热为患，则为阳黄；中阳不足，湿从寒化，寒湿为患，则为阴黄”。进一步明确了阳黄与阴黄的病机，即阳黄证病机为湿热阻滞。

现代研究表明，肝病患者多伴有黄疸[1-7]，阐明阳黄证的发病机制及相关药物的作用机制将有助于指导临床肝病诊治的症候理论研究和合理用药。本课题组前期收集500例阳黄证患者尿液，并对其进行基于高通量技术的代谢组学分析，获取44个尿液潜在生物标记物，为阳黄证的临床诊断及发病机制研究提供重要依据。

栀子为茜草科植物栀子的干燥成熟果实，2015版《中国药典》收录栀子具有清热利湿，凉血解毒的功效，主治湿热黄疸等疾病。京尼平苷为栀子的主要成分，近年来药理研究表明，京尼平苷具有良好的保肝利胆功效[8-11]。本研究采用基于代谢调控通路技术对京尼平苷干预阳黄证小鼠的作用靶标进行研究，为京尼平苷治疗黄疸类疾病提供可靠依据。

1 实验材料

1.1 仪器

AcquityTM UPLC液相色谱仪（美国Waters公司）；SynaptTM G2Si-HDMS质谱仪（美国Waters公司）；MassLynx V4.1工作站（美国Waters公司）；Progenisis QI 1.0（美国Waters公司）；VX-Ⅱ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技公司）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Basic/70VB0370半自动生化分析仪（法国Secomam公司）；紫外分光光度计（日本Shimadzu制作所）电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KDC-160HR型高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SK-1型快速混匀器（江苏金坛医疗器械厂）。

1.2 药品和试剂

ALP试剂盒、ALT试剂盒、AST试剂盒、T-Bili试剂盒、D-Bili试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号分别是YZB/京0691-2010、YZB/京0694-2010、YZB/京0693-2010、YZB/京0096-2013、YZB/京0121-2013），KMAS试剂盒、T-SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒、γ-GT试剂盒、TBA试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号分别是20160719、20160721、20160715、20160723、20160726、20160725），α-萘异硫氰酸酯（上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：N106359），橄榄油（中粮食品营销股份有限公司），干姜（同仁堂药店哈尔滨分店），京尼平苷（中国生物制品检定所，纯度大于95%，批号：110749-200511）。蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料公司），冰醋酸（天津天力化学试剂公司），乙腈（色谱级，德国Merck公司），甲醇（色谱级，德国Merck公司），甲酸（色谱级，科密欧化学试剂公司），乙醇（北京化工厂），生理盐水（实验室自制），其他试剂均为分析级。

1.3 给药样品制备

1.3.1 制备干姜灌胃液

称取干姜生药材50.8 g，加入10倍量（即500 mL）蒸馏水浸泡1 h，大火煎煮至沸腾，小火煎煮1 h，纱布滤过，滤液置于烧杯中；再加入10倍量蒸馏水，重复以上过程两次，合并3次滤液，浓缩至500 mL，-80℃冰箱冻存。每天融化15.6 mL浓缩液，加入104.4 mL蒸馏水稀释，制成浓度为0.013 g·mL-1的干姜灌胃溶液；小鼠按体重以10 mL·kg-1比例灌胃。

1.3.2 制备乙醇灌胃液

量取3.125 mL无水乙醇，加入96.875 mL纯净水，混匀，配制成3.125%（v/v）乙醇溶液；小鼠按体重以10 mL·kg-1比例灌胃。

1.3.3 制备ANIT橄榄油溶液

分别称取37.5、25 mg的ANIT粉末溶于25 mL橄榄油中，制成浓度为1.5、1 mg·mL-1的ANIT橄榄油灌胃液；小鼠按体重以10 mL·kg-1比例灌胃。

1.3.4 制备京尼平苷灌胃液

分别取京尼平苷标准品粉末336、168、84 mg，精密称定，分别以28 mL的0.3%CMC溶液混悬，后溶于5.6 mL蒸馏水中，作为京尼平苷高（10 mg·mL-1）、中（5 mg·mL-1）、低剂量（2.5 mg·mL-1），小鼠分别以生药量100、50、25 mg·kg-1作为高、中、低剂量进行灌胃。

2 实验动物分组及给药

清洁级雄性Babl/c小鼠，体重20±2 g，辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。饲养温度24±2℃，湿度65%-75%，12 h蔽光，12 h光照，自由摄食饮水。按体重完全随机分成7组，即空白1组（Control 1）、空白2组（Control 2）、模型1组（M 1）、模型2组（M 2）、高剂量京尼平苷组（GH）、中剂量京尼平苷组（GM）、低剂量京尼平苷组（GL）。实验前于代谢笼适应饲养一周，空白1组和2组灌胃给予生理盐水和橄榄油。模型1组和2组及给药组给予0.13 g·kg-1的干姜溶液和0.25 g·kg-1的乙醇溶液，连续14天，第15天灌胃给予15 mg·kg-1的ANIT橄榄油溶液，第16天上午灌胃给予10 mg·kg-1的ANIT橄榄油溶液，实验第16天下午开始各给药组连续7天灌胃给予京尼平苷低中高药物。

2.1 样品采集

每天每组每只小鼠收集尿样，冻存于-80℃冰箱。实验第17天早空白1组和模型1组小鼠摘眼球采集血样；实验第23天早空白2组、模型2组及各给药组小鼠摘眼球采集血样，离心（4℃，3 000 r·min-1，10min）分离血清，冻存于-80℃冰箱；同时取肝脏称重，保存在10%福尔马林溶液和-80℃冰箱中备用。

2.2 临床化学及组织病理学检测

按试剂盒说明操作检测血清碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、谷丙转氨酶（Alanine Transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、直接胆红素（Direct Bilirubin，D-Bili）、总胆红素（Total Bilirubin，T-Bili）、谷氨酰转肽酶（Gamma-Glutamyl Transpeptidase，γ-GT）、总胆汁酸（Total Bile Acid，TBA）和组织谷胱甘肽过氧化酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malonyl Dialdehyde，MDA）、总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）。小鼠采血后，立即摘取肝脏，蒸馏水洗净残血，10%福尔马林溶液固定24 h后，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片，展平，脱蜡，HE染色，脱水，封片，供组织病理学观察使用。

2.3 代谢组学数据采集

样品分析前室温解冻，取小鼠原浓度尿液与蒸馏水1∶4（v/v）混溶，涡旋10 s，离心（4℃，13 000 r·min-1，10 min），取上清液供UPLC分析。色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（美国Waters公司）；流动相A：0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B：0.1%甲酸水溶液；柱温；40℃；进样量：2 μL；梯度洗脱程序见表1。质谱条件：正离子扫描模式下毛细管电压3 000 V；锥孔电压30 V；离子源温度：110℃；提取锥孔电压5.0 V；脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量50 L·h-1；脱溶剂气流量800 L·h-1。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽（[M+H]+=556.277 1）溶剂为锁定质量溶液。质量扫描范围：m/z 50 - 1 200。负离子扫描模式下毛细管电压2 500 V；锥孔电压30 V；离子源温度：110℃；提取锥孔电压5.0 V；脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量50 L·h-1；脱溶剂气流量800 L·h-1。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽（[M-H]-=554.261 5）溶剂为锁定质量溶液。质量扫描范围：m/z 50 - 1 200。

2.4 数据处理

采用Excel 2007对空白1组和模型1组的所有数据进行独立样本t检验，以组间P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异，数据以（± s）表示。

2.5 阳黄证小鼠尿液代谢轮廓及生物标记物分析

为了更全面地研究在阳黄证小鼠代谢轮廓中起关键性作用的内源性物质，揭示代谢图谱的特征变化，进而深入挖掘和阐明阳黄证小鼠的代谢机制，本研究在对不同组小鼠尿液正负离子扫描分析的基础上，一方面应用ProgenesisTM QI数据处理系统对空白1组、模型1组尿液的代谢轮廓数据进行非监督

表1 尿液样品UPLC流动相梯度洗脱方法

图1 空白1组、模型1组、空白2组、模型2组和京尼平苷给药组小鼠组织病理学结果（×100）

3.3 代谢组学研究

对比正负离子模式下采集的空白1组及模型1组小鼠尿液数据可知，两组小鼠尿液成分具有巨大差异，将造模第16天小鼠尿液代谢轮廓数据导入Progenesis QI软件进行数据预处理过程，进一步利用EZinfo软件对空白组和模型组进行主成分分析，结果发现：模型组小鼠尿液与空白组显著分离，且组内聚集良好，提示模型组小鼠体内代谢已经发生巨大变化。进一步通过有监督的正交偏最小二乘判别分析，获取到具有统计学差异的小分子代谢产物（图2）。锁定符合上述标准的潜在生物标记物，以G2Si-HDMS/MS模式精确采集相应离子的二级裂解信息，根据HMDB及KEGG等数据库对已获得的母离子及碎片离子信息最终确定标记物的化学结构。进一步通过MetaboAnalyst 3.0通路富集分析、HMDB、KEGG等相关代谢数据库检索共发掘33个代谢物，涉及22个代谢通路，包括酪氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、泛醌等萜醌的生物合成、谷胱甘肽代谢、苯基丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、硫胺素代谢、维生素C代谢、叶酸碳库代谢、维生素B6代谢、苯基丙氨酸代谢、泛酸和辅酶A的生物合成、叶酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯代谢、β-丙氨酸代谢、乙醛酸盐代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨酰tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、初级胆汁酸代谢（图3、图4）。这33个小分子代谢产物中有10个与临床黄疸证患者的生物标记物分子结构相同[12]，分别为肾上腺素（Epinephrine）、葡萄糖酸（Gluconic acid）、5-甲氧基色氨酸（5-Methoxytryptophan）、L-r-谷氨酰-L-亮氨酸（L-gamma-glutamyl-L-leucine）、L-b-天冬氨酰-L-苯丙氨酸（L-beta-aspartyl-L-phenylalanine）、5,6-二氢尿苷（5,6-Dihydrouridine）、N-甲酰-L蛋氨酸（N-Formyl-L-methionine）、犬尿喹啉酸（Kynurenic acid）、3b,16α-二羟基雄甾烯酮硫酸盐（3b,16α-Dihydroxyandrostenone sulfate）、Vanillactic acid。而且，这些标记物存在于黄疸证的关键代谢通路，如酪氨酸代谢、戊糖-葡萄糖醛酸转换、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等，由此证明本次建立的阳黄证动物模型与临床阳黄证具有高度的一致性。

图2 空白组与模型组的高通量代谢轮廓及模式识别分析

3.4 利用Ingenuity Pathway Analysis技术预测京尼平苷的作用靶点

Ingenuity Pathway Analysis（IPA）是一体化的在线整合分析软件，其运算完全基于Ingenuity Knowledge Base收集的生命科学数据库的大数据云计算，有助于理解在基因、蛋白质、化学物质和药物等各种分子的属性及其分子之间相互作用关系网络。本次实验所得33个生物标记物经京尼平苷干预后均具有一定回调趋势，将其属性及相应变量带入IPA软件中分析，可有效、直观的获取京尼平苷干预阳黄证的潜在作用靶点（图5）。通过分析发现京尼平苷干预阳黄证小鼠的主要作用靶点主要为干扰素调节因子3（Interferon Regulatory Factor 3，IRF3）、鸟氨酸脱羧酶抗酶1（Ornithine decarboxylase enzymes 1，OAZ1）、鸟氨酸脱羧酶1（Ornithine Decarboxylase 1，ODC1）、解偶联蛋白（Uncoupling Protein 1，UCP1）、Maf1调节剂（Maf1 Regulator）。

图3 京尼平苷干预阳黄证模型小鼠代谢通路图

图4 空白2组、模型2组和京尼平苷给药组小鼠尿液潜在生物标记物变化

4 讨论

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，通过核磁共振和色谱、质谱串联技术为主的分析技术获得代谢图谱数据，在此基础上借助化学计量学工具和模式识别软件转换成相应的信息，用以考察生物体系受刺激或扰动前后小分子代谢产物的动态变化，研究生物体系代谢网络，揭示疾病发生发展的动态过程及挖掘特异性生物标志物或标志群，为疾病诊断、治疗、甚至药物的设计提供指导[13-22]。

本研究中模型组小鼠尿液潜在生物标记物主要涉及22个代谢网路，这些代谢网络涉及到的代谢机制都与阳黄证的发病机制极其相关。本次阳黄证动物模型研究中共计发掘33个潜在尿液生物标记物；与临床阳黄证证患者的尿液生物标记物比对发现，有10个小分子代谢产物完全一致，且这些标记物处于黄疸的关键代谢通路，如酪氨酸代谢、戊糖、葡萄糖醛酸转换、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等，由此证明本次建立的阳黄证动物模型与临床阳黄证具有高度的一致性。

京尼平苷为中药材栀子的有效成分，在消化道内经肠道内β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）作用下水解成京尼平[23]。现代药理学研究表明，其具有保肝利胆、降血糖、神经营养和神经保护和对大鼠慢性前列腺炎的治疗作用等。GSH-Px是临床检测机体抗过氧化能力的常用指标之一，具有抗氧化作用和解毒作用。Kuo W H[24]等发现京尼平苷可以提高大鼠肝细胞中GSH S转移酶活性及GSH-Px活性，进而保护受损肝细胞。本研究结果表明，与空白2组相比，MH2组小鼠体内GSH-Px活性降低，给予低中高不同剂量的京尼平苷后，小鼠体内GSH-Px活性成上升趋势，由氰基氨基酸代谢网络可知，京尼平苷在肠道内经β-葡萄糖苷酶代谢生成京尼平，此过程可能由于肠道菌群为代谢京尼平苷而大量产生β-葡萄糖苷酶，使其在肠道内代谢其他物质的也同步加速进行，最终代谢产生大量的甘氨酸，而甘氨酸是内还原型谷胱甘肽合成所需物质之一，大量的甘氨酸可以加速机体产生还原型谷胱甘肽，用于消除体内由于过氧化而导致的炎性反应，起到修复受损肝细胞的作用。

图5 京尼平苷干预阳黄证小鼠的网络靶点预测分析

本研究利用代谢组学技术研究京尼平苷对阳黄证小鼠的干预作用。在基于中医证候理论认识的基础上，以中药结合化学结合诱导胆汁淤积肝损伤的化学物质作为造模因素建立阳黄证动物模型，经高通量的数据采集及数据处理最终发现33个尿液生物标记物，给予不同剂量京尼平苷后都能给予很好的回调，使生物标记物的含量回归接近空白组水平，

在阳黄证相关代谢网络中，有效调节谷胱甘肽代谢等关键代谢通路。基于以上数据，通过IPA组学分析系统对鉴定的标记物进行靶点预测分析，结合代

表3 阳黄证小鼠尿液生物标记物鉴定结果

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An Exploration in the Action Targets for the Avail of Geniposide Against Yang Huang Syndrome Based on the Regulation of Metabolic Pathways

Fang Heng, Zhang Aihua, Zhou Xiaohang, Yu Jingbo, Wang Liang, Liu Chang, Song Qi, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The present study aimed at exploring the targets and the pathogenesis of the avail of geniposide against Yang Huang syndrome (YHS) using metabolic technologies. YHS mouse model was established by three methods, including chemicals, Chinese materia medica and pathologic hepatic injury. On this basis, the biomarkers of YHS, various biochemical indexes and pathology observation were adopted to evaluate the modeling of YHS. Compared with the control group, it was found that the contents of ALT, AST, T-Bili and TBA were successfully increased in the model group with significant statistical differences (P＜0.05). The levels of ALP, D-Bili, MDA and γ-GT were up-regulated, while the levels of GSH-Px and T-SOD were down-regulated. Besides, pathological observation indicated regional patchy necrosis and hepatic edema emerged in the model mice. Involving metabolic profiling analysis, a total of 33 urinary biomarkers were identified in the model mice, which all associated with YHS, and among which 10 biomarkers were identified that they shared the same structure with the biomarkers of YHS. These biomarkers were chiefly involved in tyrosine metabolism, taurine and hypotaurine metabolism and glutathione metabolism, pentose and glucuronate metabolism, and primary bile acid metabolism. With the global omics analysis of IPA software, we predicted 5 targets engaged in the avail of geniposide against YHS, including OAZ1, ODC1, UCP1 and Maf1 regulator. In conclusion, this study successfully established the YHS mouse model based on the guidance of traditional Chinese medical theory and the essential characteristics of YHS. 10 biomarkers shared the same structure with those of YHS, which played critical roles in the process of the metabolism of YHS. Strikingly, these biomarkers were recovered to the normal levels after the adminstration of geniposide. The aforesaid descriptions indicated that the establishment of the YHS model showed a high consistency with clinical YHS patients. Geniposide may perform favorable efficacy with the aforementioned biomarkers or pathways.

Metabolomics, geniposide, Yang Huang syndrome, biomarker, target

10.11842/wst.2016.10.009

R285.5

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-20

＊ 国家自然科学基金委重点项目（81430093）：中药体内药效物质基础的系统分析方法学——中医方证代谢组学研究，负责人：王喜军；科学技术部“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09101043-011）：中药经典名方整合作用机制关键技术研究，负责人：王喜军。

＊＊ 通讯作者：王喜军，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中药血清药物化学及中医方证代谢组学研究。