基于中医方证代谢组学技术的六味地黄丸干预脑瘫大鼠模型研究＊

李秋菊，王 萍，王美佳，康舒宇，张 也，张爱华，王喜军

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

基于中医方证代谢组学技术的六味地黄丸干预脑瘫大鼠模型研究＊

李秋菊，王 萍，王美佳，康舒宇，张 也，张爱华，王喜军＊＊

（黑龙江中医药大学国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心/国家中医药管理局中药血清药物化学重点研究室/中美中医方证代谢组学技术合作中心 哈尔滨 150040）

目的：本研究基于中医方证代谢组学理论和技术平台，研究六味地黄丸（LW）对脑瘫大鼠模型的干预作用。方法：研究采用延迟剖宫产手术方法复制缺氧缺血脑瘫（HICP）大鼠模型，利用经典行为学方法对HICP模型和LW的干预作用进行评价；最后借助中医方证代谢组学技术揭示了HICP模型大鼠尿液的潜在生物标记物与LW干预HICP模型体内显效成分的相关性。结果：研究表明LW通过调节HICP模型大鼠机体的糖类代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和甾体激素类生物合成四大类代谢途径，进而有效改善HICP模型大鼠的运动能力，并确定LW的入血成分中6-O-甲基梓醇、莫诺苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脱水的代谢产物为干预HICP大鼠模型的潜在药效物质基础。本证实了中医方证代谢组学技术可以成为阐明中药药效物质基础的有力手段。

中医方证代谢组学 缺氧缺血脑瘫 六味地黄丸 药效物质基础 代谢物 中医药 中药血清药物化学 代谢组学

2012年，本团队将中药血清药物化学与代谢组学有机整合，提出并建立中医方证代谢组学（Chinmedomics）研究策略[1]，为全面揭示中药药效物质基础提供了新的思路与方法[2,3]。滋阴补肾的经典名方六味地黄丸（Liu Wei Di Huang Wan，LW），于《小儿药证直诀》中首创，最初是用于治疗小儿的“五迟、五软”证[4]。小儿因先天肾精亏虚导致的发育迟缓症被称为“五迟、五软”证,表现为立迟、行迟、语迟、齿迟、发迟以及手软、足软、肌肉软、口软、头项软[5]。现代医学研究表明，小儿脑瘫归属于“五迟、五软”证的范畴[6]。然而目前LW对“五迟、五软”证起到干预作用的化学成分以及这些成分对机体代谢网络的调节作用仍尚不清楚，所以本研究以LW治疗小儿“五迟、五软”证的经典疗效为切入点，在缺氧缺血脑瘫（Hypoxic-Ischemic Cerebral Palsy，HICP）大鼠模型的基础上，进行LW的中医方证代谢组研究。

1 材料

1.1 仪器

电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；美国Waters AcquityTMUPLC液相色谱仪（四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱）；美国Waters SynaptTMHDMS 质谱分析系统；MassLynx V4.1工作站；氮吹仪（美国Organomation公司）。

1.2 药品与试剂

熟地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮，六味中药材购于北京同仁堂哈尔滨药店。

乙腈（色谱级，德国Merck公司）；甲醇（色谱级，美国Fisher公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲酸（色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司）；亮氨酸脑啡肽（美国Sigma公司）；乙醚（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.3 药液的制备

1.3.1 六味地黄丸给药样品的制备

依据2015版《中国药典》，同时为了全面地检出中药血清移行成分，引导后续实验开展，并按照大鼠剂量和人体剂量的折算关系，将成人口服LW的一日剂量折合成本实验中大鼠的LW低剂量，将成人口服LW一日剂量的5倍折合成本实验中大鼠的LW中剂量，将成人口服LW一日剂量的10倍折合成本实验中大鼠的LW高剂量。根据上述依据，按比例取六味中药材并充分混合，10倍量甲醇中浸泡30 min后，超声提取40 min，重复3次，合并滤液，减压浓缩，得到LW提取液浓膏。向浓膏中加入事先配制好的0.5%的CMC-Na溶液充分混悬，制备成含生药量0.81 g·mL-1混悬液，即为LW高剂量，并逐级稀释成0.405 g·mL-1，即为LW中剂量，以及0.081 g·mL-1，LW低剂量，配置好的药液4℃保存备用。

1.3.2 六味地黄丸供试品溶液的制备

按比例称取6味中药材，共计12.5 g，加入10倍量甲醇125 mL，超声30 min，于4℃、13 000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液备用，供进样分析。

1.4 实验动物

本实验已明确预产期的妊娠SD雌性大鼠25只，体质量250±20 g，购置于黑龙江中医药大学动物安全性评价中心，许可证号P00102004。

2 方法

2.1 模型复制

本实验采用瑞典学者Bjelke[7]在1991年首次提出的延迟剖宫产手术法，结合李星儿等[8]对该模型的改良方法，复制本研究的先天性HICP模型大鼠。取12只临产的大鼠打开腹腔后用4个止血钳分别夹闭双侧子宫角血管，夹闭10 min时，立即从子宫取出新生大鼠，用棉签对新生大鼠进行术后抢救，最终成活100只；另取3只临产的大鼠仅进行剖宫产手术，不用止血钳夹闭子宫角血管进行延迟，最终得到27只成活的新生大鼠；剩余10只临产大鼠需至少提前1天自然分娩。

2.2 动物分组与给药

共分为5组，即仅行剖宫产手术得到的仔鼠随机选取20只作为假手术对照组（Control，C）；行延迟剖宫产手术得到的新生大鼠随机选取80只并平均分成4组即模型组（Modle，M），LW低剂量给药组（LWL）、LW中剂量给药组（LWM）、LW高剂量给药组（LWH），（保证雌雄比例1：1）。各给药组大鼠每天给予相应剂量LW提取液灌胃，对照组与模型组给予蒸馏水灌胃。由于前期预实验结果发现采用延迟剖宫产手术复制的HICP模型大鼠在49日龄内处于研究设计需要的病理状态，所以最终的给药时间为从大鼠21日龄离乳到大鼠49日龄，共计28天，给药量为10 mL·kg-1。

2.3 术后饲养

研究选取自然分娩的10只母鼠作为代乳鼠，先将其取出置于另一鼠笼中，并将其所产仔鼠全部丢弃，然后将上述五组新生大鼠标记好组别每窝10只分别埋入每只代乳鼠笼里的垫料中，充分接触，待20 min后将代乳鼠放回原笼中即可。

2.4 生物样品的收集与制备

从新生大鼠21日龄开始，尿液样本每隔七天收集一次，采集后于4℃，13 000 rpm，离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液供UPLCHDMS分析；血液样本于最后一次给药后1 h内进行采集，并于4℃，3 500 rpm离心10 min分离血清，并采用甲醇沉淀法即用6倍量甲醇进行蛋白沉淀。

2.5 行为学方法检测

依照李晓捷等[9]给出的脑瘫动物的神经行为学标准，并结合本实验中的HICP模型大鼠的自身情况分别选取悬吊实验、斜坡实验、旷场实验和拒俘反应实验对各组大鼠成长阶段的行为能力进行考察。

2.6 尿液代谢组学测试方法

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTMHSS T3（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；流动相：A为0.1%甲酸乙腈，B为0.1%甲酸水；梯度洗脱程序为0-2.5 min，1%-11%A，2.5-4.5 min，11%-25% A，4.5-8 min，25%-60%A，8-8.5 min，60%-99%A。质谱条件：正离子模式下毛细管电压2.6 kV，样品锥孔电压30 V，提取锥孔电压3.0 V，脱溶剂气温度300℃，脱溶剂气流量600 L·h-1；负离子模式下毛细管电压2.0 kV，样品锥孔电压35 V，提取锥孔电压3.5 V，脱溶剂气温度200℃，脱溶剂气流量600 L·h-1。

2.7 六味地黄丸体内外成分检测方法

为避免分析结果的无效重叠，本次正负离子模式以及体内外样品均采用一套分析条件，即色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：A为0.1%甲酸乙腈，B为0.1%甲酸水；梯度洗脱程序为0-2 min，10%-35%A，2-3 min，35%-60%A，3-6 min，60%-80%A，6-8.5 min，80%-99%A。质谱条件：毛细管电压：2.8 kV；锥孔采样电压：35 V；锥孔提取电压：3.2 V；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流量：600 L·h-1；离子源温度：110℃。质谱数据在Continuum全扫描方式下应用MS E模式进行采集。

2.8 数据处理

2.8.1 统计学分析

测得数据采用SPSS 18.0软件进行两因素方差（two-way ANOVA）分析，多组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

图1 各组大鼠行为学分析

2.8.2 生物标记物分析

将所得尿液代谢组学数据导入Waters Progenesis QI软件，结合Ezinfo 2.0软件对大鼠尿液代谢轮廓进行分析，再应用QI软件中Identify Compounds鉴定成分模块，对HICP模型大鼠尿液潜在生物标记物在Human Metabolome Database＊（HMDB）数据库进行相关检索，最终利用Masslynx 4.1软件Massfragment模块对圈定的生物标记物进行二级结构验证。

2.8.3 血中移行成分分析

分别采用UNIFI软件对LW体内外成分进行直观比较以及Masslynx 4.1软件中的Metabolynx模块对LW干预HICP模型大鼠有效状态下的血中移行成分进行分析。

2.8.4 相关性分析

运用血清化学成分与代谢标记物相关性分析法（Plotting of Correlation between Marker Metabolites and Serum Constituents，PCMS），对LW入血成分谱与效应标记物进行关联分析，将LW入血成分群与潜在生物标记物含量变化矩阵导入PCMS软件，设定相关系数（r）1和2均为0.7，运算后导出相关分析结果Heatmap图，以0.7≤r≤1作为潜在药效物质基础筛选标准，经过进一步筛选圈定干预HICP模型的潜在药效物质基础。

3 结果

3.1 行为学检测结果

各组大鼠行为学检测结果（见图1），与假手术对照组相比，HICP模型组大鼠表现为在玻璃棒上悬吊的时间较短，在斜坡上完成调转头向上的时间较长，30 s内的活动较少，且很容易被抓取，且通过两因素方差分析发现，HICP模型组大鼠在斜坡、旷场和拒俘实验中表现出显著性差异，说明延迟剖宫产手术能够影响新生大鼠整体行为能力；但随着LW给药时间的延长，HICP模型大鼠的各项行为能力都有所改善，与模型组相比，3个给药组大鼠在斜坡和拒俘实验中显示出了显著性差异，说明口服LW能够一定程度上提高HICP模型大鼠的整体行为能力。

3.2 代谢组学分析结果

在给药第0天即大鼠21日龄时，对假手术对照组与模型组代谢轮廓进行分析，得到相应的得分图（图2-1）和S&VIP-plot图（图2-2），最终表征了HICP模型大鼠尿液中20个潜在生物标记物（见表1和2），并进一步分析发现这些标记物主要通过影响脑神经中枢和肾脏功能两方面进一步扰动糖类代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、甾体激素类生物合成五大代谢途径。

对LW给药第28天时5组大鼠代谢轮廓进行PCA及PLS-DA分析，得到相关尿液代谢轮廓得分图（见3-1和图3-2），结果表明口服LW使得HICP模型大鼠尿液代谢谱发生明显变化，显示LW各给药组的代谢轮廓较模型组更加接近假手术对照组，且LW给药组能够通过调节的代谢经路包括糖类代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和甾体激素类生物合成四大类代谢途径回调HICP模型大鼠尿液20个潜在生物标记物中的13个，具体含量变化图（见图4）。

图2 LW给药第0天即新生大鼠21日龄时假手术对照组与模型组大鼠尿液代谢物S&VIP-plot图

3.3 六味地黄丸血中移行成分分析

利用UPLC-HDMS技术对LW干预HICP有效状态下的血中移行成分进行分析，共发现了20个血中显效成分；包括14个LW体外原型成分及6个代谢产物，详细信息见表3和表4。

3.4 潜在药效物质基础研究

采用PCMS分析方法计算20个色谱峰与HICP模型大鼠尿液潜在生物标记物的相关系数，结果见分析热图（见图5）。进一步对PCMS处理得到的结果进行总体归纳，显效成分在不同剂量组中与生物标记物高度相关的个数达到9个及以上，认为该显效成分为与HICP生物标记物高度相关成分。最终圈定了5个成分，分别为：6-O-甲基梓醇、莫诺苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脱水的代谢产物，均为LW干预HICP模型的潜在药效物质基础。

表1 正离子模型下HICP模型大鼠尿液中潜在生物标记物的具体信息表

表2 负离子模型下HICP模型大鼠尿液中潜在生物标记物的具体信息表

图3 LW不同剂量干预HICP模型大鼠尿液代谢轮廓Score plot图

图4 LW干预HICP模型大鼠尿液中潜在生物标记物的含量变化图

表3 基于直观比较法LW的血中移行成分鉴定结果（即原型入血成分）

表4 基于Metabolynx数据处理方法的血中移行成分鉴定结果（药物代谢物入血成分）

图5 LW血中移行成分与HICP模型尿液潜在生物标记物相关性分析热图

4 讨论

中医理论中，肾和脑从属于一个系统，两者在生理上相互滋补，在病理上相互影响[10]，而小儿稚阳纯气，无须益火，所以宋代太医丞钱乙首创了滋补肾阴的名方六味地黄丸用于治疗小儿的“五迟、五软”证。依据此理论，本研究选择现代医学中临床表现与“五迟、五软”证相近的小儿脑瘫动物模型作为研究对象。相关文献中记载缺氧缺血脑瘫模型是最常用的小儿脑瘫模型，然而延迟剖宫产手术法较颈动脉结扎法不仅操作简单，可一次性获得大量模型大鼠，最重要的是能够高度模拟人类新生儿因宫内窘迫而致缺氧缺血脑瘫的病理进程以及符合“五迟、五软”证的中医病机。因此，最终我们采用延迟剖宫产手术法复制HICP模型。

续图5 LW血中移行成分与HICP模型尿液潜在生物标记物相关性分析热图

目前临床上诊断小儿脑瘫，主要依靠其特征性的临床表现，故经典的神经行为学检验是评价脑瘫动物模型的重要手段，本研究分别从肌力、身体协调性、空间适应能力和情感行为能力4个方面对LW给药前后大鼠的行为进行综合评价。又由于每个时间点每组大鼠在每个行为学实验中表现参差不齐，所以本实验又采用行为学总分的方法更直观的对5组大鼠的整体行为能力进行评价。行为学结果表明了延迟剖宫产手术成功地复制了大鼠缺氧缺血脑瘫模型，同时说明了LW能够在一定程度上改善HICP模型大鼠的整体行为能力。

本研究借助代谢组学技术平台，从分子水平描述了HICP模型的病理状态，以及LW通过滋阴补肾的作用调节HICP模型大鼠的肾脏功能，进而改善大脑神经中枢以及身体各方面机能的作用机制，涉及四大类代谢途径包括：糖类代谢通路、氨基酸代谢通路、核苷酸代谢通路、甾体激素类合成。其中，糖类代谢通路又包括能量代谢和氨基糖苷类代谢，而氨基糖苷类代谢异常，N-乙酰神经氨酸经肾脏消除减少则会造成唾液酸堆积[11,12]，从而引起小儿脑瘫症的发生。结果显示HICP模型大鼠给予LW后，体内过量的N-乙酰神经氨酸减少，表明LW可能通过提高肾脏对N-乙酰神经氨酸的消除作用从而有效改善小儿脑瘫的症状。

续图5 LW血中移行成分与HICP模型尿液潜在生物标记物相关性分析热图

氨基酸代谢又包括酪氨酸、色氨酸以及精氨酸和脯氨酸代谢。其中MHPG-SO4是脑中去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）硫酸化的代谢物。NE是中枢神经系统内重要的神经介质，它对体内许多生理活动具有调节作用[13]。前期研究表明，精神抑郁症患者血清中MHPG-SO4的表达水平明显低于健康群体[14]，这可能是造成本研究中HICP模型组较假手术对照组在旷场实验和拒俘反应实验中的表现较差的原因，而HICP模型大鼠给予LW后MHPG-SO4相对含量增加，空间适应能力和情感行为能力有所增强，表明LW可能通过调节HICP模型大鼠体内MHPG-SO4的含量，从而有效改善HICP模型大鼠的行为能力。

核苷酸代谢中包括嘌呤核苷酸代谢和嘧啶核苷酸代谢，其中嘌呤核苷酸体内的终产物尿酸是临床上用于诊断肾脏功能的重要指标[15]。同时，尿酸的甲基衍生物，3-甲基尿酸和1,3-二甲基尿嘧啶可以作为嘌呤核苷酸代谢异常以及泌尿系统结石的标志[16,17]。本研究结果中HICP模型大鼠尿液中尿酸、黄嘌呤核苷酸、3-甲基尿酸和1,3-二甲基尿嘧啶的含量明显高于假手术对照组，而LW各给药组大鼠尿液中以上各项指标含量明显低于HICP模型组，提示LW可能通过增强体内嘌呤核苷酸分解代谢能力以及某些肾脏功能从而缓解HICP模型大鼠的病理状态。

甾体激素类合成代谢中雄烯二酮减低会导致男性发育迟缓造成侏儒症[18,19]。研究结果中HICP模型大鼠尿液中雄甾烯二酮的含量较假手术组偏低，这可能是造成模型组大鼠较对照组发育迟缓的原因。而LW正是通过改善大鼠体内的甾体激素类合成从而促进HICP模型大鼠的生长发育。

通过行为学和代谢组学结果阐明了LW对HICP模型干预作用的基础上，利用中药血清药学化学的理论和方法，对LW干预HICP模型有效状态下的体内直接作用成分进行分析，最终发现了20个入血成分，又通过PCMS软件，建立LW体内直接作用成分“谱”对生物标记物“效”的关系，即提取与内源性生物标记物高度相关的外源性中药成分，并最终筛选出6-O-甲基梓醇、莫诺苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脱水的代谢产物为LW干预HICP模型潜在药效物质基础。

综上所述，本研究借助中医方证代谢组学理论和技术，表明六味地黄通过调节机体的糖类代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和甾体激素类生物合成四大类代谢途径，有效改善缺氧缺血的病理状态，从而干预小儿脑瘫发生发展的病理过程。并通过PCMS软件筛选出LW干预HICP模型潜在药效物质基础即6-O-甲基梓醇、莫诺苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脱水的代谢产物。中医方证代谢组学理论是揭示中药的药效物质基础的有力手段。

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Impacts of Liu Wei Di Huang Wan (LW) on a Rat Model of Cerebral Palsy Based on Chinmedomics

Li Qiuju, Wang Ping, Wang Meijia, Kang Shuyu, Zhang Ye, Zhang Aihua, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

This study aimed to explore the pharmacodynamic material basis of Liu Wei Di Huang Wan (LW) in the rat model of cerebral palsy and its mechanism based on the theory and technological platform of Chinmedomics. The delayed cesarean operation was performed to establish the rat model of hypoxic-ischemic cerebral palsy (HICP) and ensued the evaluation of the model with classical behavior and the administration of LW. At last, the correlation between the potential biomarkers of HICP was computed and the markedly component of LW in vivo was explored by the technologies of chinmedomics. It was found that four categories of metabolic pathways of HICP rats were regulate within the administration of LW, involving carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, nucleotide metabolism and steroid hormone synthesis biological metabolic, to promote motor ability of HICP rats. It was determined that 6-O-methylcatalpol, morroniside, verbascose, paeonolide, and the dehydrated metabolite of Sweroside were the potential pharmacodynamic materials of LW in its treatment of HICP. It was concluded that chinmedomics was a powerful method of clarifing the pharmacodynamic materials of Chinese materia medica.

Chinmedomics, hypoxic-ischemic cerebral palsy, Liu Wei Di Huang Wan, pharmacodynamic materials, metabolites, traditional Chinese medicine, serum pharmacochemistry of Chinese materia medica, metabolomics

10.11842/wst.2016.10.008

R285

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-17

＊ 国家自然科学基金委重点项目（81430093）：中药体内药效物质基础的系统分析方法学——中医方证代谢组学研究，负责人：王喜军；科学技术部“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09101043-011）：课题名称：中药经典名方整合作用机制关键技术研究，负责人：王喜军；国家自然科学基金委面上项目（81473584）：基于新生大鼠脑瘫模型的六味地黄丸治疗“五迟”、“五软”证的作用机理及药效物质基础研究，负责人：王萍。

＊＊ 通讯作者：王喜军，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中药血清药物化学及中医方证代谢组学研究。