蛋清活性肽的研究进展

郑　颖,方卿颖,佟　平,陈红兵,3,高金燕,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学食品学院,江西南昌 330047;3.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047)



蛋清活性肽的研究进展

郑颖1,2,方卿颖2,佟平1,2,陈红兵2,3,高金燕2,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学食品学院,江西南昌 330047;3.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047)

我国蛋品资源丰富,鸡蛋蛋清不仅是优质蛋白质的来源,也是产生活性肽的原料。蛋清蛋白经不同的酶水解后产生不同活性的功能片段,比如抗氧化、调节血压、抗凝血、抑菌、改善记忆等。文章介绍了蛋清活性肽的制备方法及活性研究现状,论述了蛋清活性肽的未来重点研发前景,以期为后续深入的基础研究和应用开发提供参考。

蛋清,肽,活性

生物活性肽是蛋白质中20种天然氨基酸以不同排列方式和组成构成的线性或环形肽类的总称。一般氨基酸数目在2～20之间,分子量小于6000 u的肽段具有较好的生物活性。活性肽在完整的蛋白质结构中时没有生物活性,只有对蛋白质进行胃肠消化、发酵或酶解等作用释放后才可发挥一定的生理作用[1],其活性主要取决于肽段的氨基酸种类、排列方式等[2]。活性肽的来源比较广泛,从动物或植物的蛋白质中均可获得。植物蛋白来源主要有小麦、燕麦、豆类等,动物来源主要有牛奶、蛋类和鱼类等[3]。活性肽兼具营养性和功能性,其吸收效果优于氨基酸并且安全无毒副作用,可用于食品基料、慢性疾病的预防和化妆品生产等方面,具有很好的研究价值和发展前景。

蛋清活性肽研究最早始于1995年,Fujita[4-5]等人证明了卵白蛋白的酶解产物具有抑制血管紧张素转化酶的活性,从此开启了人们对鸡蛋蛋白活性肽的关注。蛋清中含有高达9.7%～10.6%的蛋白质以及丰富的脂质和维生素、矿物质等,其中蛋清中的卵转铁蛋白、溶菌酶、卵白蛋白、卵粘蛋白等结构中含有许多功能片段。蛋清蛋白酶解后产生的肽段具有优于原料蛋白质的性能和其无法比拟的生物活性[6],比如抗氧化、调节血压、改善记忆、抑菌、缓解疲劳[7]、调节胆固醇、调节血糖[8]、抗凝血[9]、抗炎症反应[10-11]、抗肿瘤[12]和提高免疫力,蛋清活性肽的研究将为鸡蛋的开发、利用和提高附加值提供了一条有效的途径。

1　蛋清活性肽研究现状

1.1蛋清活性肽的制备

利用溶剂萃取、酸碱水解、酶解和生物发酵等方法都可从蛋白质中获得生物活性肽[13]。其中酶解法是一种在不破坏蛋白质营养价值的前提下且能提高其功能性质的安全、有效方式[14],其作用条件温和,酶解过程易控制,是目前制备蛋清活性肽最常用的方法。将蛋清蛋白稀释至一定浓度,适当的加热处理使蛋白质的结构松散,利于酶解。使用单酶或复合酶酶解得到酶解产物,即肽和蛋白质的混合物,然后通过调节pH或加热方式把酶灭活。使用截留不同分子量的超滤膜,可将肽混合物根据分子量分开。为了得到纯度更高、活性更强的单一肽段,可将其进行色谱分离。比如:将超滤后的某一高活性组分在离子交换色谱柱或凝胶色谱柱中分离,收集活性更高的组分,再利用反相高效液相色谱法进一步纯化直到得到单个活性肽段,最后用质谱测定其氨基酸序列[15]。此外,蛋清高F值寡肽的制备同样采用酶解法,但因其酶解物中含有大量游离芳香族氨基酸,所以要用吸附法或过滤分离法进行脱芳处理,方可获得高F值寡肽液。

1.2蛋清活性肽的活性研究

1.2.1抗氧化肽机体新陈代谢产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),活性氧自由基包括超氧化物阴离子、羟基自由基、过氧化氢和一氧化氮等。糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、癌症等一些慢性疾病与ROS有密切的关系。ROS容易攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子加重细胞损伤[16]。抗氧化肽通过抑制或清除自由基来保护细胞和线粒体的正常结构和功能,防止脂质过氧化,从而达到预防和治疗自由基诱发的慢性疾病和抗衰老的目的。目前已有从蛋清或蛋清蛋白中纯化的一些具有抗氧化活性的肽段,比如YLGAK、GGLEPINFQ、SALAM、YQIGL、YRGGLEPINF、PEY、LPDE、WVE、NTDGSTDYGILQINSR[17]、LDEPDPL和NIQTDDFRT[18]等。Chang[19]等利用生物蛋白酶酶解卵粘蛋白,酶解液呈现出较强的ABST自由基清除活性;牛慧慧[20]等人使用胃蛋白酶酶解冻干的蛋清,结果表明:在1～20 mg/mL范围内蛋清肽清除羟基自由基、超氧阴离子自由基及DPPH自由基的能力均随着蛋清肽质量浓度的增加而增加,质量浓度为10 mg/mL时,DPPH自由基的清除率达到95.24%;Chen[21]等利用木瓜蛋白酶水解蛋清,分离纯化得到两种抗氧化肽,经LC-MS/MS鉴定其序列为YLGAK和GGLEPINFQ,化学合成这两种肽段并测其DPPH自由基清除能力分别为粗蛋清水解液的7.48和6.02倍;Wu[15]等从蛋清粉中纯化并鉴定出两个高抗氧化活性肽段AEERYP和DEDTQAMP,其抗氧化能力指数(ORAC)为(4.35±0.09)、(3.47±0.12) μmol TE/mg,并且肽段AEERYP与先前鉴定的序列YAEERYPIL的肽段的活性相差甚微,这说明N-末端去掉Tyr,C-末端去掉Ile-Leu后对YAEERYPIL肽段的抗氧化活性没有太大的影响,然而把肽段AEERYP中的Ala除去后其ORAC值减少到(2.21±0.04) μmol TE/mg,这预示着Ala在其抗氧化活性中起着重要作用。Tyr、Trp、Phe等氨基酸的芳香族残基和His的咪唑基团能通过电子转移淬灭自由基[22],Pro、Val、Ala、Leu和含硫氨基酸Met、Cys对肽的抗氧化活性形成也有很大的贡献,比如Pro的吡咯烷环基可与肽的二级结构相互作用,由于其较低的电离势,使其灵活性和猝灭单线态氧的能力增加,但是游离氨基酸并不能产生抗氧化活性,只有通过一定的序列结合形成肽段后才能发挥生物活性[23]。

1.2.2ACE抑制肽高血压是一种备受全球关注的严重威胁人类健康的心血管疾病,目前临床上主要靠化学药物来治疗,但其副作用大且易产生依赖性。具有降压作用的活性肽的研发,将为预防和治疗高血压提供一种新的可能。在人体血压调节系统中,血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)起着重要作用。它是一种具有广泛底物特异性的锌金属肽酶[24],能催化无升压活性的血管紧张素I(angiotensin I,Ang I)转化为具有收缩血管作用而致强效升压的血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)以及将具有血管舒张功能的舒缓激肽(Bradykinin,BK)降解为无舒张血管能力的片段[25-26]。因此,ACE在调节血压和心血管功能的肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)及激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin System,KKS)中起着关键的作用。ACE抑制剂(ACEI)作为一种与ACE活性区域结合的底物竞争性抑制剂,能阻碍AngΙ水解成AngII以及催化BK水解使之失活。Yu[27]等利用胃蛋白酶酶解蛋清得到蛋清蛋白酶解物,并分离出活性较高的血管紧张素转移酶抑制肽。Majumder[28]等人发现用声波或还原剂二硫苏糖醇(DTT)预处理蛋清中的卵转铁蛋白后,再用嗜热菌蛋白酶和胃蛋白酶酶解,获得的酶解液的ACE抑制活性相比未经预处理卵转铁蛋白的酶解液提高了20倍,并从中分离纯化出两个五肽IRWCT、IQWCA和一个四肽LKPI。目前还有一些已报道的鸡蛋来源的ACE抑制肽,比如:酶解卵白蛋白得到的FFGVRCVSP、QRKIKVYL、LW、FRAHPFL[29],酶解卵转铁蛋白得到的LVRQQT[30]等。通过对ACE抑制肽结构的大量研究发现N末端疏水性氨基酸如Ile、Leu、Val等,C末端含环氨基酸Pro、Trp、Tyr等对ACE的抑制活性有重要作用,比如用鸡蛋卵转铁蛋白中的IQW和LKP对原发性高血压小鼠进行体内实验,能分别降低血压19和30 mmHg[31];于志鹏利用胃蛋白酶通过交联葡聚糖凝胶色谱纯化从蛋清粉中得到RVPSL、QIGLF、TNGIIR等多个肽段,并用这三种活性肽分别对原发性高血压大鼠(SHR)进行单次、短期和长期灌胃,都有明显的降血压效果并对大鼠的正常生长无不良影响。经长期灌胃RVPSL和QIGLF后大鼠的收缩压降低至少30 mmHg[32]。

1.2.3抗凝血肽凝血是人体不可或缺的生理防御过程,在正常生理状态下,机体内凝血系统和纤维蛋白溶解系统处于动态平衡。但是当凝血异常,特别是凝血系统亢进时,会形成血栓。血栓性疾病如心肌梗塞、肺梗塞、脑血栓、视网膜动静脉阻塞和四肢及周围血管栓塞等疾病发生率高居各种疾病之首,严重危害人类健康[32]。凝血酶是一种在凝血过程中起关键作用的丝氨酸蛋白酶,可作为抗凝治疗的靶点,抗凝血肽可通过抑制凝血酶的活性有效阻碍凝血过程的发生[34]。Yu[35]等人从蛋清中分离纯化的肽段RVPSL兼具ACE抑制、抗氧化和抗凝血三种活性,并且在胃肠道消化检测时呈现出很好的稳定性。杨万根[36]研究发现用Protease N酶解蛋清得到的17个抗凝血酶活性肽段中疏水性和碱性氨基酸含量很高,并且抗凝血酶活性与酶解液中氨基酸的极性和带电荷性质紧密相关;王菲[37]采用胃蛋白酶水解蛋清液,酶解液经Sephadex G-50纯化后得凝血酶抑制率为85%,IC50值为28.04 mg/mL,体外半衰期约为60 min,与临床凝血酶抑制剂药物相比IC50值较大、半衰期较短,但其安全性高,来源广泛,作为预防血栓类疾病的功能食品具有很大的开发价值。

1.2.4抑菌肽抗菌肽是一类能够抵御外来细菌或其他微生物入侵的生物活性肽,它具有热稳定性和广谱抗细菌活性,其作用机理普遍认为有两种:膜结构破坏型机制和非膜结构破坏型机制。在膜结构破坏机制中,抗菌肽作用于目标菌的磷脂双分子层,抗菌肽带有的正电荷与脂质双分子层表面上的负电荷相互作用,使细胞膜穿孔,形成膜通道,细胞质外溢,从而达到杀菌的目的,其中抗菌肽的水脂双亲结构起到了关键的作用[38]。非膜结构破坏型机制中,抗菌肽破坏细胞壁、抑制DNA合成、抑制细胞呼吸等生化反应进程[39-40]。朱伶俐[41]以鸡蛋溶菌酶为原料,选取金黄色葡萄球菌为实验菌种,采用比浊法选择胃蛋白酶,以高温处理后的抑菌率为指标优化酶解条件,分离得到的氨基酸序列为MKRHGLDNY的肽段具有较好的耐热性且对革兰氏阳性菌有抗菌作用。Pellergrini[42]等用胰蛋白酶水解卵白蛋白,得到五个抗菌肽SALAM、SALAMVY、NVLOPSS、ELINSW、YPILPEYLQ,用糜蛋白酶处理得到三个抗菌肽AEERYPILPEYL、GIIRN和TSSNVMEER,通过化学合成这八种肽段,发现它们对枯草芽孢杆菌均具有很强的抑制性,对黏质沙雷氏菌、绿脓假单胞菌、支气管炎博德特菌和大肠杆菌有一定强度的抑制性,其中TSSNVMEER和GIIRN的抑菌活性最强。郑建[43]用胃蛋白酶在40 ℃下水解卵转铁蛋白2 h,分离纯化得到具有抗革兰氏阴性菌(G-)和革兰氏阳性菌(G+)活性的肽组分,该组分对G+更敏感,其中测得对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为60 μg/mL,对大肠杆菌的最小抑菌浓度为100 μg/mL。

1.2.5改善记忆肽随着年龄的增长,人类机体自然老化和大脑退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病、多发性硬化症等都会造成记忆下降[44]。大脑创伤和由压力引起的失眠、抑郁、焦虑等都会对大脑造成一定损伤,导致头痛、记忆力下降等。研究表明,记忆的下降或退化与大脑的海马区病变、神经递质减少以及突触病变等有关[45]。目前虽然发现许多食源性的改善记忆活性肽,但是对其具体作用机制还未研究透彻,在蛋清改善记忆活性肽的研究方面,许海丽[46]用碱性蛋白酶和风味蛋白酶双酶酶解蛋清蛋白粉得到蛋清高F值寡肽,用两周龄的小鼠进行水迷宫实验,在灌胃72 d时水迷宫所需时间最少,改善小鼠记忆效果最佳。

1.2.6高F值寡肽高F值寡肽是一类由2～9个氨基酸残基组成的F值大于20的混合寡肽体系。F值是指混合物中支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸,简称BCAA)与芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸,简称AAA)的含量之比[47],即BCAA/AAA。高F值寡肽中富含的具有较强疏水作用的支链氨基酸是人体内的必需氨基酸,使得高F值寡肽在人体的生理活动中发挥多种生物活性。高F值寡肽的应用从保肝护肝、辅助性治疗肝性脑病及苯丙酮尿症延伸到解酒醒酒、抗疲劳、抑制癌细胞增殖及其他生物活性领域。目前国内有一些学者对蛋清高F值寡肽的制备技术和活性进行探讨,有研究用蛋清高F值寡肽灌胃健康小白鼠,以其皮肤中羟脯氨酸含量来评价皮肤衰老的程度。结果显示不同浓度蛋清高F值寡肽均可以明显提高受试小鼠皮肤中羟脯氨酸含量,说明蛋清高F值寡肽在抗衰老方面也具有一定的作用[48]。

2　蛋清活性肽研发的前景展望

2.1蛋清活性肽的新活性及增效技术

虽然在蛋清活性肽的研究方面已经取得一定的成果,但除了文中所述蛋清肽的几种活性以外,是否还有其他的功能活性有待进一步发掘。现在多用碱性蛋白酶、胃蛋白酶和风味蛋白酶等常用酶类对其进行酶解,是否还有其它一种或几种酶能更好地作用于蛋清蛋白制备活性肽,使其产生更高的生物活性还有待进一步研究。虽然蛋清活性肽已经具有不错的活性,但是与相关药物相比,其活性依然有待提高。如果能通过增效技术再次增加其活性,这将会有很高的实际价值和意义。研究发现,对大豆蛋白酶解液进行类蛋白反应修饰后,ACE抑制活性显著提高[49];更有研究[50]发现肽与肽之间或肽与非肽类等其他功效因子协同作用比单一组分具有更好的效果,这可能是因为具有不同作用机制的功效因子之间存在互补或相互修复作用。

2.2蛋清活性肽定量构效关系的研究

定量构效关系(Quantitative structure activity relationship,QSAR),是通过研究现有的活性物质,以其结构参数或理化参数为自变量,生物活性为因变量,用数学模式来表达生物活性物质的化学结构信息与特定的生物活性强度之间的关系[51]。QSAR可作为一种定量描述活性肽结构与活性关系的有效方式。在多肽的定量构效关系研究中,一般采用组成多肽的氨基酸残基的结构参数定量描述多肽的化学结构。活性肽的定量构效关系研究是其生物活性研究至关重要的一部分,随着药物化学和计算化学的迅速发展,QSAR技术也在不断更新和推进。新的QSAR研究理论也将因技术的逐步成熟而在蛋清活性肽以及其他生物活性肽领域得到充分的应用。

2.3蛋清活性肽的体内吸收和活性评价

目前对二肽和三肽在体内的完整吸收已经得到普遍的认可,但是氨基酸序列大于3的活性肽在体内的生物利用率和吸收转化情况还需进一步验证,也是食源性功能肽研究中一个亟待解决的问题。在活性肽的体内吸收评价方面,多用Caco-2细胞模型模拟小肠上皮细胞进行物质的吸收评价。Caco-2细胞系来源于人类结肠癌细胞,在培养条件下能自动分化成单层细胞,其结构和生化特点均类似于人类小肠上皮细胞,可用于模拟研究营养物质及药物等在小肠上皮的吸收代谢等情况。但是Caco-2细胞由于缺乏小肠上皮中的黏液层以及细胞色素P450的一些同工酶与人体中的差异等原因,此方法也存在不足。同时一些活性肽在体外评价时活性较高,但经胃肠消化后是否保留其活性,也需要进一步验证。未来的研究还需要在动物或人类志愿者体内进行更为详细地研究,以便更好地了解活性肽在人体内的吸收转化、代谢以及服用耐受量等情况。

2.4蛋清活性肽的工业化生产

现在对活性肽的研究大多是以分离纯化出单个高活性肽段为主,虽然其中的科研价值不可估量,但是耗时、耗力、得率低、成本高,不利于大量制备及工业化生产。通过可控酶解、优化其工艺参数等技术大量制备出高活性蛋白水解母液或粗分离组分,更具有产品开发价值[52],使用适度的亚基解离、变性技术等对原料进行前处理和多酶偶联控制酶解等技术对蛋清的可控酶解、高效制备都有极大地促进作用。国外现已有一些企业把乳清蛋白肽、鲣鱼肽、酪蛋白肽、大豆肽作为降血压、提高免疫力等功能性食品或食品基料进行工业化生产,国内也有企业把苦瓜肽、大豆肽、玉米肽、菜籽肽商业化生产成具有降胆固醇、促进脂质代谢和辅助降血压等作用的功能食品和养生保健品。我国蛋品资源丰富,鸡蛋产量居世界首位,可为活性肽的生产提供丰富而廉价的原材料。研究发现,用鸡蛋蛋白制备活性肽活性优于乳蛋白活性肽[53]。国外已有公司分别生产出具有降血压、治疗糖尿病功能的鸡蛋活性肽产品。目前国内商业化的蛋清活性肽产品还很少,将其进行工业化生产不仅能满足现代人对绿色功能食品的需求,而且还有利于拓宽禽蛋产品市场,延伸禽蛋产业链,对于开发禽蛋的高附加值产品具有重要意义,其潜在的经济价值和市场前景不言而喻。

3　结语

生物活性肽因其优质的品质和潜在功能价值引起了越来越多学者的兴趣,成为国际上一个备受关注的研究领域。鸡蛋清蛋白作为含有人体八种必需氨基酸的优质蛋白,是获得优质活性肽的良好资源。利用酶解法可制备出活性强、安全性高的蛋清活性肽。蛋清活性肽作为一种兼备营养和功能价值的蛋清深加工产品,对其深入研究并应用于功能食品、化妆品或医药行业,将对鸡蛋产业的发展以及人类的健康有极大地促进作用。

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[53]吴建平. 鸡蛋中生物活性肽的机遇与挑战[J]. 中国家禽,2012(13):39.

Advance of bioactive peptides derived from egg white

ZHENG Ying1,2,FANG Qing-ying2,TONG Ping1,2,CHEN Hong-bing2,3,GAO Jin-yan2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Egg is rich in resources in our country. Egg white is considered as a rich source of high quality proteins with various bioactive peptide fractions. Enzymatic hydrolysis of egg white can be used to release bioactive fractions and different enzymes have different abilities in releasing bioactive fractions,like antioxidant activity,angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory activity,anticoagulation properties,antimicrobial activity and improving memory ability. In order to provide the

for the related research of bioactive peptides derived from egg white,the preparation and evolution method of activity were introduced. Meanwhile,the development direction in future of egg white peptides were discussed.

egg white;peptide;activity

2016-01-28

郑颖(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生，E-mail：13767000769@163.com。

高金燕(1967-)，女，硕士，教授，研究方向：食品营养与安全，E-mail：gaojy2013@ncu.edu.cn。

国家“863”计划(2013AA102205)；江西省自然科学基金计划(重点项目)(20133ACB20009)；江西省国际合作项目(20111BDH80026)；食品科学与技术国家重点实验室目标导向课题(SKLF-ZZA-201612)。

TS253.4

A

1002-0306(2016)18-0396-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.068