青麻叶大白菜根肿病人工接种方法及条件研究

张　红,张　斌,王超楠,李　梅,黄志银,刘俊峰

(1.天津师范大学 生命科学学院,天津　300387;2.天津科润蔬菜研究所,天津　300384)



青麻叶大白菜根肿病人工接种方法及条件研究

张红1,张斌2,王超楠2,李梅2,黄志银2,刘俊峰1

(1.天津师范大学 生命科学学院,天津300387;2.天津科润蔬菜研究所,天津300384)

摘要：为辅助青麻叶大白菜的抗病育种研究,以青麻叶大白菜秋绿60种子为试验材料,比较了5种接种方法(菌土法、密封菌土法、蘸根法、注射法、浸种法)不同土壤pH值、菌液浓度、光照及根系分泌物等接种条件对人工接种效果的影响。结果发现,菌土法与其他接种方法相比效果更好、更稳定,浸种法效果最差。在土壤pH值为酸性时更易发病,且pH值达到6.5时,病情指数最高;每g土接种0.050 g病根是最适宜的接种浓度;光照对病害的发生有促进作用;番茄和抗、感根肿病的白菜根系分泌物均能促进病害的发生。因此,在青麻叶大白菜的人工接种试验中可采用以上最佳接种方法及条件提高接种效果。

关键词：根肿病;青麻叶大白菜;接种方法;接种条件

根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)引起的一种世界性土传病害[1],该病传染力强,传播途径广,危害损失较大,防治困难,主要为害大白菜等十字花科作物。近年来,根肿病在云南、湖北、贵州、山东、辽宁等十字花科蔬菜种植区发生严重,并迅速蔓延,目前全国大部分省份均有发生,已成为制约十字花科蔬菜生产的主要因素之一。至今我国根肿病的常年危害面积约320万~400万hm2,占十字花科作物栽培总面积的1/3以上,平均年产量损失达20%～30%,发病严重地块的年产量损失高达60%以上[2]。目前防治根肿病的手段主要是进行抗性育种,而接种方法及条件的探索是进行相关研究的基础。虽然,国内外已有学者对根肿病的接种方法及条件进行探索,但针对青麻叶大白菜的研究尚未见报道,且由于影响因素复杂,根肿菌又存在生理小种分化,至今尚未形成一套统一而稳定的接种体系[3]。为此,本试验在前人的研究基础上[4-7],以青麻叶大白菜为接种对象,探讨5种常用接种方法的发病效果及不同pH值、菌液浓度、光照和其他根系分泌物等条件对人工接种效果的影响,以建立一套适合青麻叶大白菜的人工接种鉴定体系,为抗病育种提供参考依据。

1材料和方法

1.1试验材料

供试品种为秋绿60青麻叶大白菜,由天津科润蔬菜研究所提供。供试菌株为大白菜根肿病发病肿根,采自云南省昆明市嵩明县,取回后洗净,于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2试验方法

1.2.1休眠孢子液的制备制备休眠孢子液参考郭向华等[8]、杨文强[9]的方法,称10 g病根组织用榨汁机捣碎,然后经过3层纱布过滤,将滤液经1 020 r/min离心5 min,弃上清,用50 mL灭菌水重溶沉淀,再次离心5 min,弃去上清,向离心管中加5 mL 50%蔗糖溶液混匀,离心5 min,吸取上清至新离心管,再次离心10 min,弃上清,反复2次,最后将沉淀溶于5 mL灭菌水。休眠孢子悬浮液用血球计数器计数,并在4 ℃条件下贮藏备用。

1.2.2不同接种方法发病效果的比较试验菌土法：按比例将制备好的休眠孢子液和无菌土混合,使菌土孢子含量达到108个/g,将pH值调至6.5,含水量控制在60%左右,然后将配好的菌土置入装满灭菌营养土的育苗穴盘中,把种子播于菌土上,少量蛭石覆盖。苗盘置于温室通风阴凉处,25 ℃条件下生长,避免阳光长时间直晒,苗盘下保持1 cm水层,30 d后调查发病情况。

密封菌土法：按比例将制备好的休眠孢子液和无菌土混合,使菌土孢子含量达到108个/g,将pH值调至6.5,含水量控制在60%左右,然后用塑料膜将配好的菌土密封48 h 后,再将菌土置入装满灭菌营养土的育苗穴盘中,把种子播于菌土上,少量蛭石覆盖。苗期管理同上,30 d后调查发病情况。

蘸根法：选取培养10 d的健康幼苗,洗净根部,浸在孢子浓度为108个/mL的菌液中4 h,再把幼苗移植到装有灭菌土的育苗钵中。苗期管理同上,30 d后调查发病情况。

注射法：将种子播于装有灭菌营养土的育苗穴盘中,播种后用移液器吸取孢子浓度108个/mL的菌液1 mL注射于种子下方。苗期管理同上,30 d后调查发病情况。

浸种法：将种子浸在配制好的孢子浓度为108个/mL的菌液中4 h,然后将种子播于盛有灭菌营养土的育苗穴盘中,少量蛭石覆盖。苗期管理同上,30 d后调查发病情况。

以上每个处理播种25穴,每穴留苗2株,3次重复。

1.2.3不同土壤pH值对接种效果的影响将菌根加适量水,放入榨汁机中捣碎呈匀浆,按菌根和灭菌营养土1∶20(m/m)的比例配制菌土,采用密封菌土法进行接种后,用pH值分别为 5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5的水进行浇灌,使育苗盘下保持1 cm水层。每处理25穴,每穴留苗2株,3次重复。苗期管理同上,30 d后调查发病情况。

1.2.4不同接种浓度对接种效果的影响采用密封菌土的方法接种,每g灭菌土接种菌根0.005,0.010,0.020,0.050,0.100,0.200 g,每处理25穴,每穴留苗2株,3次重复,苗期管理同上,30 d后调查发病情况。

1.2.5光照对接种效果的影响按1∶20(m/m)的比例配制菌土,采用密封菌土法进行接种,播种2周后,对苗盘分别进行15 d日光处理和遮光处理,每个处理25穴,每穴留苗2株,3次重复。苗期管理同上,播种30 d后调查统计结果。

1.2.6植物根系分泌物对接种效果的影响选用番茄和抗、感根肿病白菜的种子经催芽后播在盛有Hoagland营养液的50 mL小烧杯里的纱布上,每杯各播10株,使根系生长后浸入营养液中,7 d后收集含根系分泌物的溶液。

按1∶20(m/m)的比例配制菌土,采用密封菌土法进行接种,然后在菌土中分别添加番茄、抗根肿病白菜、感根肿病白菜的根系分泌物溶液,以添加不含分泌物的Hoagland营养液为对照,每个处理25穴,每穴留苗2株,3次重复。苗期管理同上,30 d后调查统计结果。

1.3数据统计

根肿病病情的分级参照2012年王彤彤等[10]的方法,分为7级。

0级:根系正常,无病害;

1级:主根未发生病害,须根、侧根有个别细小根瘤;

3级:主根出现病害症状但肿大不明显,须根、侧根较多根瘤或根瘤直径或长度超过0.5 cm;

5级:主根肿大明显,肿大部分直径为茎基的2～3倍,大部分须根、侧根有肿瘤;

7级;主根肿大明显,肿大部分直径为茎基的3倍以上。

病株率和病情指数计算公式如下:

病株率=(发病株数/总株数)×100%;

病情指数=∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)。

数据采用SPSS 17.0软件Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1不同接种方法对接种效果的影响

采用5种接种方法,以相同的接种浓度和土壤pH值对秋绿60进行根肿病接种。由表1可知,菌土法的接种效果最好,发病率为100%,病情指数为77.14;其次是密封菌土法,发病率为93%,病情指数为56.12;再次是蘸根法和注射法,病情指数分别为51.42和48.74;浸种法的接种效果最差,发病率和病情指数都极显著低于其他4种方法。

表1　不同接种方法对发病的影响

注：不同大写字母表示差异极显著(P=0.01)。表2-5同。

Note:Different capital letters indicates extremely significant difference (P= 0.01).The same as Tab.2-5.

2.2不同土壤pH值对接种效果的影响

由表2可知,利用密封菌土法接种,在其他条件一致的情况下,当土壤pH值为5.0～6.5时发病率和病情指数均较高,发病率都达到了65%以上,病情指数均接近或达到30以上,其中pH值为6.5时,发病率和病情指数最高,分别为70%和36.04,极显著高于其他处理。但当pH>6.5时,发病率和病情指数均大幅下降。由此可知酸性条件利于发病,且pH=6.5是最佳接种pH值,这也与根肿菌休眠孢子的萌发特性相符[11]。

表2　不同土壤pH值对发病的影响

2.3不同接种浓度对接种效果的影响

本试验设置了6个接种浓度,采用密封菌土法进行接种,发病情况结果统计如表3所示,接种浓度由每g土0.005 g病根至0.050 g病根时,发病率和病情指数均随接种浓度的升高而上升,接种浓度为每g土0.050 g病根时,发病率和病情指数均达到最高,分别为89%和56.35,极显著高于其他处理,但当接种浓度再继续升高后,接种效果反而有所下降。因此,每g土接种0.050 g病根为最适接种浓度。

表3　不同接种浓度对发病的影响

2.4光照因素对接种效果的影响

由表4可知,在温度、pH值、菌液浓度一致的条件下经过光照处理后,根肿病的发病率和病情指数均极显著高于黑暗处理,说明光照对根肿病发病有促进作用,分析其原因是光照处理刺激寄主产生大量的芸苔葡萄硫甘从而引起植物根系肿大[12]。

表4　光照因素对发病的影响

2.5番茄、抗感白菜根系分泌物对接种效果的影响

由表5的鉴定结果可以看出,番茄和抗、感根肿病白菜的根分泌物溶液极显著提高了发病率和病情指数。这可能是由于非寄主的根分泌物溶液对休眠孢子的萌发有促进作用,但其具体机理还有待进一步探讨。

表5　植物根系分泌物对发病的影响

3结论与讨论

本试验首次全面比较了5种根肿病接种方法对青麻叶大白菜接种效果的影响,发现5种接种方法中菌土法的病情最重,这与司军等[13]认为菌土法比蘸根法诱导发病严重的观点一致。但黄蓉等[3]及李妍等[14]则认为密封菌土法比菌土法发病更为严重,分析结论不同的原因可能有以下两方面:第一、所用试材及菌种来源不同所致;第二、本试验中配制密封菌土的环境温度较高,密封后菌土的温度可能会达35~40 ℃左右。根据肖崇刚等[15]的研究,甘蓝根肿病菌休眠孢子最适萌发温度为24 ℃,其平均萌发率高达73.76%;随着温度的升高萌发率均呈逐渐下降趋势,当温度上升到40 ℃时,萌发率仅为5.52%。据此,本试验中可能是密封的高温导致休眠孢子萌发率下降,从而最终使密封菌土法致病力低于菌土法。

此外,根肿病的发生与土壤pH值、光照及其他植物的根系分泌物等因素也有着密切的关系。本试验表明在酸性土壤pH值下接种效果最好,这也与酸性条件更利于根肿菌生存萌发的生物特性相符[16-18]。对于休眠孢子浓度与发病之间的关系,试验发现每g土接种0.050 g病根属最适的接种浓度。根据Siemens等[19]的标准,每g土接种0.05 g病根的孢子浓度约为108个/g。周永红等[20]、司军等[13]也曾提出每g土2×108个孢子最适宜接种,该论点正与本试验结果相符,说明该接种浓度重复性较好,发病效果较稳定。

由光、暗处理的对比发现,光照对根肿病的发生有促进作用,光照处理能刺激寄主产生大量的芸苔葡萄硫甘从而引起植物根系肿大,但具体作用机理还有待于进一步研究。另外添加了番茄和抗、感根肿病白菜根系分泌物的处理,病情指数明显提高,表明根系分泌物能促进休眠孢子的萌发与繁殖,前人研究发现休眠孢子囊萌发需要植物根部渗出物-烯丙基异硫氰酸的刺激[21]。本研究结果与前人报道一致。

本试验对青麻叶大白菜根肿病接种的各个影响因素进行了比较全面的比较分析,筛选出了适宜的接种方法及条件,为青麻叶大白菜的抗病育种研究提供了有价值的参考依据。

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Study on Inoculation Methods and Condition of Clubroot in Qingmaye Chinese Cabbage

ZHANG Hong1,ZHANG Bin2,WANG Chaonan2,LI Mei2,HUANG Zhiyin2,LIU Junfeng1

(1.College of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin300387,China;2.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,Tianjin300384,China)

Abstract：For the disease-resistant breeding of Qingmaye Chinese cabbage,five kinds of inoculation methods(Indigenous bacteria,Seal of indigenous bacteria,Dip method,Injection method,Seed soaking method),different soil pH,different inoculation concentration,illumination and root secretion were compared by use Qiulü 60 as material in this article.The results showed that the effect of soil inoculation was more excellent and stable.In contrast,seed-immersion method was the poorest.The acid soil pH was fit to clubroot break out and the disease index reached the maximum when pH value was 6.5.1 g soil inoculated 0.050 g root was the most suitable inoculation concentration.After light treatment,the disease index was increased,it showed that light had a promoting effect on diseases.Root secretion of tomato,resistant and susceptible hosts could promote the happening of disease.Therefore,in the artificial inoculation test of Qingmaye Chinese cabbage can be the above optimum inoculation method and conditions so as to improve the effect of inoculation.

Key words:Clubroot;Qingmaye Chinese cabbage;Inoculation method;Inoculation condition

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.029

中图分类号：S634.01

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)01-0182-04

通讯作者：张斌(1965-),男,辽宁本溪人,研究员,博士,主要从事十字花科蔬菜育种研究。

作者简介：张红(1990-),女,天津武清人,在读硕士,主要从事大白菜分子育种研究。

基金项目：国家“十二五”支撑计划项目(2012BAD02B01-14);天津市科技成果转化与推广项目(201402010)

收稿日期：2015-07-15