葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

吕兆勇,赵春梅,薛仁镐

(1.聊城市人民医院，山东 聊城　252000;2.青岛农业大学 生命科学学院,山东 青岛　266109)



葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

吕兆勇1,赵春梅2,薛仁镐2

(1.聊城市人民医院，山东 聊城252000;2.青岛农业大学 生命科学学院,山东 青岛266109)

摘要：为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用PlantCARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到pCAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4 ℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。

关键词：葡萄;PCAN启动子;胁迫诱导表达;GUS检测

植物基因的表达调控主要发生在转录水平,由启动子和与之相互作用的转录因子共同完成,受到多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。启动子是一段位于结构基因5′端上游区的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确地结合,并具有转录起始的特异性。启动子按照转录方式可以分为:组成型、组织特异型和诱导型启动子[1]。植物受到逆境(低温、高盐、干旱等)胁迫时会产生相应的应答反应,以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危害。逆境胁迫诱导型启动子可以诱导植物在各种不良生长环境中表达抗逆基因,使其表现出一定的抗逆性。在逆境胁迫条件下,转录因子与胁迫应答基因启动子的顺式作用元件结合,特异地启动应答基因的转录表达,从而作出调节反应。目前,关于逆境胁迫诱导型启动子有很多报道,例如Weising等[2]研究发现,Atrd29A基因启动子具有干旱、高盐及低温胁迫响应的顺式作用元件。Kasuga等[3]比较了由CaMV35S组成型启动子和冷诱导rd29A启动子分别驱动CBF基因在转基因烟草中的低温抗性和生长状况,发现由rd29A启动子驱动的转CBF基因植株比由CaMV35S启动子驱动的转基因植株所表现出来的生长延滞要轻微的多。Roychoudhury等[4]将水稻的Rab16A基因转化到烟草中,并由Rab16A基因启动子来驱动,然而研究发现Rab16A基因只有在高盐胁迫条件下才会表达,且植株的生长状态正常,表现出明显的耐盐能力,表明Rab16A基因启动子是盐胁迫诱导型启动子。Manavella等[5]对向日葵HAHB4启动子的研究发现,在HAHB4启动子上含有ABRE元件。对转HAHB4基因的拟南芥和向日葵进行GUS染色和RT-PCR分析,结果显示ABRE元件对ABA、NaCl和干旱胁迫做出反应。在胁迫诱导型启动子中发现多种与非生物胁迫相关的顺式作用元件及转录因子,如DRE元件及DREB类转录因子、MYB元件及MYB类转录因子、GT-1元件及GT-1类转录因子等[6-8]。

本研究从葡萄(VitisviniferaL.)中克隆了1个逆境相关的基因(登录号:CAN70200.1),为明确该基因的表达特性,依据葡萄基因组序列,克隆了该基因的启动子片段,分析了启动子序列中含有的顺式作用元件,并构建该启动子的融合GUS基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株,并对其进行逆境胁迫处理,分析其在烟草各组织中的表达特性,为揭示该基因在葡萄生长发育及非生物逆境应答中的生物学功能奠定基础。

1材料和方法

1.1材料与试剂

植物材料:葡萄幼苗由青岛农业大学遗传实验室提供。

载体与试剂:大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105感受态细胞与载体pCAMBIA1391Z由青岛农业大学遗传实验室保存提供;DNA聚合酶、限制性内切酶、pMD19-T载体和植物基因组DNA提取试剂盒购于TaKaRa(大连)公司;各种生化试剂购置于上海生工生物工程有限公司。

1.2葡萄幼叶基因组DNA的提取

参照植物基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书提取葡萄新鲜幼叶的基因组DNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

1.3PCAN启动子克隆

根据目的基因的上游启动子序列设计引物VvESTPF (5′-ACACTCGTCCCATCTCCCATC-3′),VvESTPR (5′-TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC-3′),以提取的葡萄幼叶DNA为模板,使用TaKaRaTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR扩增,按照说明书中的PCR体系进行扩增。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收后克隆到pMD19-T载体(TaKaRa公司),转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组质粒命名为pMD19T-CAN,阳性克隆送往TaKaRa(大连)公司测序。

1.4PCAN启动子顺式作用元件分析

利用PlantCARE网站[9](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE[10](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在线分析启动子区域存在的启动子顺式调控元件。

1.5植物表达载体p1391Z-CAN的构建及鉴定

将连接顺序正确重组质粒pMD19T-CAN用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ双酶切切下目的片段,同样用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切表达载体pCAMBIA1391Z,在T4DNA连接酶作用下连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布含Kan(50 μg/mL)的固体LB平板,37 ℃倒置培养过夜。在平板上挑取单菌落,接种含Kan(50 μg/mL)的液体LB培养基中,提取质粒,进行酶切验证,将构建好的重组质粒命名为p1391Z-CAN。

1.6农杆菌介导的烟草遗传转化

用冻融法将构建好的重组质粒转化至农杆菌EHA105,采用叶盘法对烟草进行遗传转化。将切割的烟草叶片预培养2 d后,置于含有重组质粒的农杆菌EHA105侵染液中浸泡15 min左右,期间不停轻轻摇晃,使叶盘切面充分接触菌液。取出叶盘,用无菌滤纸吸去多余菌液,将叶盘置于预培养基上,26 ℃黑暗培养3 d,然后将上述预培养叶片转移至共培养基中。培养7 d左右后,转至筛选培养基中培养。待分化的抗性不定芽长出达1 cm时,将其切下转入MS含有潮霉素(Hygromycin,Hyg)10 mg/L和羧苄青霉素(Carbenicillin,Carb)250 mg/L的生根培养基上进行抗性植株生根筛选。

1.7转基因植株的分子检测

提取转基因烟草的DNA,利用根据GUS基因设计的引物GUSR(5′-TTACAGAACCGACGACTCG-3′)和GUSR(5′-TAGTGCCTTGTCCAGTTGC-3′)扩增706 bp的片段。

1.8转基因烟草的逆境胁迫处理

抗性苗T0种子萌发成苗后,做逆境胁迫处理。低温处理:将转基因烟草幼苗放在4 ℃低温分别处理0，1，2，5，10，30，60，240 min,取其叶片进行GUS染色。干旱处理:将转基因幼苗叶片放在室温25 ℃下分别处理0,15,30,60,120 min,然后进行GUS染色。

2结果与分析

2.1PCAN启动子序列克隆

利用PCR方法从葡萄幼叶基因组DNA中扩增PCAN启动子(图1),测序结果表明,该启动子大小为1 354 bp,经序列同源性比对表明,该PCAN启动子序列与网站上的序列同源性达到96%(图2)。

2.2PCAN启动子序列分析

利用PlantCARE和PLACE网站在线分析启动子区域存在可能的顺式作用元件,分析发现PCAN启动子含有TATA-box、CAAT-box序列和提高转录水平元件5′UTR Py-rich stretch。PCAN启动子含有参与逆境胁迫调控元件,例如热激应答元件HSE、厌氧诱导所需的元件ARE、参与干旱应答的元件MYCR、低温应答元件LTR、伤害应答元件WUN-motif、赤霉素应答元件MYB。启动子区还含有胚乳表达所需元件Skn-1-motif、昼夜节律控制元件Circadian。此外,在PCAN启动子还发现了多个光应答元件,包括ACE、AT1-motif、Box Ⅰ、G-box、GAG-motif、GT1-motif、SP1、TCT-motif(表1、图2)。

Marker.DL10000 Marker;1.PCR产物。

顺式作用元件Cis-actingregulatory核心序列Coresequence功能 Function 数目Number5'UTRPy-richstretchTTTCTTCTCT提高转录水平元件3ACEAAAACGTTTA光应答元件1ARETGGTTT厌氧诱导所需元件2AT1-motifATTAATTTTA-CA部分光应答元件2ATGCAAATmotifATACAAATTGAGTCA位点相关元件1Box4ATTAAT部分保守DNA光应答元件3BoxⅠTTTCAAA光应答元件4Box-W1TTGACC真菌激活子应答元件1CAAT-boxCAAT启动子和增强子普遍存在的元件10CAT-boxGCCACT分生组织表达相关的元件1EREATTTCAAA乙烯应答元件1G-boxGACGAC光应答元件1GAG-motifGGAGATG部分光应答元件1GT1-motifGGTTAA光应答元件1HSEAAAAAATTTC热激应答元件1LTRCCGAAA低温应答元件1Skn-1-motifGTCAT胚乳表达所需元件1SP1CC(G/A)CCC光应答元件1TATA-boxTATAAAT距转录起始位点30个碱基的启动子中心元件17TCA-elementGAGAAGAATA水杨酸应答元件1TCT-motifTCTTAC部分光应答元件1WUN-motifAAATTTCCT伤害应答元件1as-2-boxGATAATGATG茎特异性表达和光应答元件1CircadianCAANNNATC昼夜节律控制元件1MYCRCANNTG干旱应答元件5MYBTAACAAA赤霉素应答元件1

图2　PCAN启动子序列

2.3PCAN启动子融合GUS表达载体的构建

将测序正确的重组质粒pMD19T-CAN用EcoR Ⅰ和PstⅠ双酶切获得目的片段,同时将表达载体pCAMBIA1391Z也用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切,将目的片段和载体胶回收后,根据浓度确定最合适的连接体系,目的片段连接到载体上后,经双酶切鉴定,在重组质粒双酶切约1 400 bp的PCAN启动子片段(图3),双酶切结果和预期目的条带大小一致,说明获得了PCAN启动子融合GUS表达载体p1391Z-CAN。

2.4农杆菌介导的烟草遗传转化

利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,农杆菌侵染后,经共培养基培养2~3 d(图4-A),转移至筛选培养基进行抗性芽的筛选(图4-B),具有抗性的芽生长旺盛(图4-C),待抗性芽生长到2 cm时(图4-D),将抗性芽切下转移至生根培养基,使其生根(图4-E),最后转至花盆中,进行室温培养即炼苗(图4-F),获得抗性苗。

2.5PCAN启动子转基因烟草的PCR鉴定

抗性苗T0种子萌发成苗后,取烟草抗性苗的幼叶,提取基因组DNA,根据设计的GUS基因的引物,利用PCR检测。部分转基因植株的结果如图5所示,表明PCAN启动子已经转入这些植株。

Marker.DL12000 bp Marker;1.重组

A.共培养;B.抗性芽筛选;C.抗性芽;D.抗性芽约2 cm;E.生根;F.抗性苗的驯化。

Marker.DL2000 bp Marker;1~4.抗性苗;5.未转基因的烟草(对照)。

2.6转基因植株逆境胁迫处理

为了检测逆境条件下PCAN启动子的表达特性,在低温、高温、盐、干旱胁迫处理条件下,对转基因烟草叶片中的GUS表达进行了检测。取鉴定阳性的T0转基因烟草的幼叶,对其4 ℃低温处理设置时间1~240 min,进行GUS组织染色,结果显示,未转基因烟草对照处理和转基因植株未处理的都没有被染色,而转基因植株在低温处理1 min时就已开始表达,10 min时表达很高,30~60 min时,表达最高,240 min后开始有所减弱,说明PCAN启动子是受低温胁迫诱导表达(图6-A)。将T0转基因烟草幼叶取下,在室温25 ℃下分别放置15,30,60,120 min。结果表明,转基因未处理的对照,没有检测到GUS表达,而干旱处理15 min时有微弱表达,在处理120 min时,叶片染色最深(图6-B),说明PCAN启动子是受干旱胁迫诱导表达。在高温和盐胁迫下,未检测到GUS基因表达。

A.4 ℃低温胁迫诱导处理;B.干旱胁迫诱导处理。

3讨论

目前已经鉴定出的植物胁迫诱导型启动子有多种,主要分为干旱诱导型启动子、低温诱导型启动子、高温诱导型启动子、盐诱导型启动子和植物激素诱导型启动子等[11]。每一种诱导型的启动子都有一些核心顺式作用元件。例如GCC-box是乙烯应答元件,存在于许多PR基因启动子区域,在植物抗性反应和生长发育中具有重要的调控作用,TAGAAGCCGCC、AGCCGCC是GCC-box的核心序列[12]。G-box最早是Giuliano等[13]在研究光调控元件时发现的,是广泛存在于植物中的顺式作用元件,其共有序列为[C/G/T]ACGTGG[C/G],核心序列为CACGTG。目前已经研究得到许多植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件,对其结构和功能有了一定的认识。本研究所克隆的PCAN启动子经分析也发现了很多顺式作用元件,包括低温应答元件LTR、干旱应答元件MYCR、赤霉素应答元件MYB、热激应答元件HSE、厌氧诱导所需的元件ARE、伤害应答元件WUN-motif、光应答元件ACE等诱导调控元件[14-16],胚乳组织表达元件Skn-1-motif[17],以及与微生物诱导相关的调控元件Box-W1[18]等,这些顺式作用元件的存在暗示PCAN的启动子可能不仅响应非生物胁迫,同时也可能是一个生物胁迫诱导的特异启动子,能够用于葡萄抗病的分子育种中,但这一推测还需要进一步研究证实。为了明确PCAN启动子的表达特性,将该启动子与GUS基因相连,构建成植物表达载体并转化烟草。对转基因烟草进行表达分析表明,PCAN启动子能够应答低温和干旱胁迫处理,但不能被高温和盐胁迫诱导表达。在低温处理条件下,该启动子表达非常迅速,仅在处理1 min时就已开始表达,在处理10 min时,表达量迅速增加,之后表达量一直保存较高水平,表明该启动子具有低温高效诱导表达特性;同时,干旱胁迫处理结果表明,该启动子也具有干旱胁迫诱导表达特性,证实了PCAN启动子在烟草中能被干旱和低温逆境胁迫诱导表达。非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件与转录因子相互作用,在分子水平上调节植物对非生物胁迫的抗性[19-23]。本研究通过网站预测在PCAN启动子上找到了与逆境胁迫诱导有关的调控元件,为下一步探索与这些元件相互作用的转录因子,在转录水平上弄清PCAN在逆境胁迫诱导下的调控机制奠定了基础。

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Cloning and Expression Analysis of Grape′s Stress Inducible Promoter

LÜ Zhaoyong1,ZHAO Chunmei2,XUE Rengao2

(1.Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng252000,China;2.College of Life Sciences,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

Abstract：To study the expression of grape stress tolerance gene (CAN70200.1),a 1 354 bp promoter fragment (named as PCAN) upstream of the gene CAN70200.1 was isolated by using PCR technology.Promoter sequence was analyzed by the database of PlantCARE and PLACE.The result showed that the PCANsequence contained basic elements CAAT-box,TATA-box and some cis-acting elements that response to abiotic stresses,light and plant hormones.To verify the expression pattern of the promoter,the PCANfragment was fused with GUS reporter gene located on pCAMBIA1391Z to construct a plant expression vector p1391Z-CAN,followed by transformation into tobacco by Agrobacterium-meditated method.The expression activity of PCANpromoter reached highest at 120 min after drought stress treatment or at 30-60 min under 4 ℃ cold treatment condition,indicated that the PCANpromoter could express under the condition of treatments with cold and drought.

Key words:Grape;PCANpromoter;Stress induction expression;GUS assay

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.013

中图分类号：Q78;S565.1

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)01-0077-06

作者简介：吕兆勇(1986-),男,山东聊城人,在读硕士,主要从事植物分子生物学研究。通讯作者：薛仁镐(1965-),男,吉林汪清人,教授,博士,主要从事植物分子生物学研究。

基金项目：转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08010002-003-002);山东省自然科学基金项目(ZR2013CM025)

收稿日期：2015-10-10