黄瓜抗霜霉病的分子标记及相关基因的研究进展

张 志，王琪琪，贺 东

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔 161601)



黄瓜抗霜霉病的分子标记及相关基因的研究进展

张 志，王琪琪，贺 东

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔 161601)

从黄瓜霜霉菌的病原菌和发病特点、发病规律、影响发病的因素、分子标记、抗霜霉病基因相关的分离、鉴定等方面综述了黄瓜抗霜霉病的相关分子生物学领域的研究进展，并对今后的研究方向进行了展望。

黄瓜霜霉病；基因；分子标记；克隆

霜霉病是世界上危害瓜类作物的主要叶部病害之一，黄瓜霜霉病(Cucumber downy mildew)是危害70多个国家黄瓜生产的一种世界性病害。霜霉病是包括白粉病、枯萎病在内的三大病害之一。黄瓜霜霉病是由真菌门鞭毛菌亚门古巴假霜霉菌侵染引起的一种世界性病害，在适宜条件下，叶片发黄、枯死，病情发展迅速，产量亏损严重，给黄瓜生产带来巨大威胁。近年来，关于黄瓜抗霜霉病的分子生物学研究日益增多，在抗病基因分离、鉴定、分子标记等方面取得了一定进展。笔者对黄瓜抗霜霉病的分子标记及相关基因的研究进展进行综述，并对今后的研究方向进行了展望。

1　霜霉病的病原菌和发病特点

1.1病原菌古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubnsis(berk.etCurt.)Rostov)是一种专性寄生菌，属于鞭毛菌亚门霜霉菌目和假霜霉属。病菌的孢子囊梗无色，从气孔伸出，单生或2～4根束生，上部呈3～5次锐角分枝，分枝末端着生一个柠檬形或卵形孢子囊，孢子囊可释放出游动孢子或萌发长出芽管，变为圆形休止孢子，萌发芽管，侵入寄主，产生孢子囊适宜温度15～20 ℃，萌发适宜温度15～22 ℃[1]。

1.2发病特点霜霉病侵染以叶片为主。苗期发病，子叶上起初出现褪绿斑，不规则形状，且病斑逐渐呈黄色，随着病情发展子叶很快变黄，枯干；成株期发病，叶片上初现浅绿色水浸斑，扩大后黄绿色转淡褐色，呈多角形，后期病斑汇合成片，由叶缘向上卷缩，全叶干枯，严重时全株叶片枯死[2]。2个时期潮湿时均生出灰黑色霉层于叶背面病斑上。

2　发病规律

气流和风雨是霜霉病菌孢子进行传播的主要媒介，且对空气湿度要求较高，棚内有结露，叶面有水滴是发病的必要因素。叶片上有水滴，15 ℃下孢子囊经1.5 h即可萌发，游动孢子2.0 h即可萌发侵入引起发病，在形成病斑后，空气湿度与孢子囊形成的速度和数量成正比，在叶面有水滴和饱和湿度的条件下，随着寄主叶组织充水，病斑发展加剧，可产生大型的孢子囊，否则孢子囊不能萌发，且2～3 d后即丧失萌发能力，霜霉病发病的适宜温度是15～24 ℃，低于15 ℃或高于28 ℃不易发病，温度越高，越不易发病[3]。

3　影响发病的因素

3.1品种间抗病性、种植环境黄瓜品种间发病有差异。一般情况下，较为感病的品种熟性较早、耐低温，相对较抗病的品种较晚熟、耐热性强。地势较高、排水良好的地块适宜黄瓜种植，同时施足底肥，合理追施氮、磷、钾肥，可降低霜霉病的发病概率。

3.2光照、温度和湿度在光照与黑暗交替的环境条件下产生孢子最多，而在持续光照下，几乎无孢子囊产生[4]。黄瓜霜霉病属于高湿病害，孢子囊在叶面有水滴或水膜时才能萌发，石延霞等[5]研究表明，叶片接种病菌后保湿2 h可引起发病，病菌侵入寄主后，环境湿度条件对病害的发展影响不大。Cohen等[6]研究发现，孢子囊产生和侵染的适宜温度为15～20 ℃。

3.3显症天数与产孢潜能的关系研究发现，显症后天数与累积孢子囊量之间呈抛物线型相关，活体叶片单位面积上产生的孢子囊量比离体叶片多[7]。且显症后天数与累积孢子囊量、病斑面积间存在较高相关性[6-9]。

4　黄瓜抗霜霉病基因分子标记的研究

黄瓜基因组较小，约为3×105kb。Kennard等[10]报道了2个与黄瓜抗霜霉病基因连锁的RFLP标记CsC230/EcoRI和CsC593/DraI，与抗性基因的遗传距离分别为9.5和17.7 cM。Horejsi等[11]鉴定出一个与控制霜霉病基因dm紧密连锁的RAPD标记BC5191100，遗传距离为9.9 cM。丁国华等[12]以L18-10-2(感霜霉病黄瓜)和129(抗霜霉病黄瓜)为亲本构建F2代分离群体，获得了一个与霜霉病抗病基因紧密连锁的RAPD标记SBSP18561，其与抗性基因的遗传距离为7.85 cM，并将该RAPD标记转化成SCAR标记SSBSP18494。但上述研究的分子标记与黄瓜霜霉病抗性基因间的遗传连锁距离均较远，刘苗苗[13]构建了8个连锁群，包括39个标记，总长度为287.4 cM，平均图距为7.37 cM，每个连锁群的标记数为2～11个，共定位到5个QTLs(dm1.1、dm3.1)，贡献率最大为19.6%。赵振国[14]获得了与ILDM10-4抗性基因(ILdm)连锁的3个SSR标记：SSR00772、SSR03529、SSR15321，它们与目标基因的遗传距离分别为3.8、6.0、16.7 cM，其中，标记SSR00772的遗传距离小于5 cM，可用于分子标记辅助选择育种，3个标记位于抗霜霉病基因两侧，为其精细定位及图位克隆奠定了基础。孟攀奇等[15]采用BSA法筛选到1个AFLP引物组合P11M70，其在抗病池和感病池间表现为多态性，抗病池和抗病亲本均具有大小约304 bp的特异谱带，感病池和感病亲本均扩增出大小约为301 bp的特异片段，经F2单株验证及连锁分析，该特异片段与霜霉病抗病相关基因相连锁，连锁距离为5.22 cM。

5　黄瓜抗霜霉病相关基因的研究

对于抗霜霉病基因的克隆，目前通常以获得抗病基因同源序列(RGA)为入口，根据抗病基因间相似序列设计简并引物，从植物基因组中得到的扩增产物与抗病基因紧密连锁，有较高的同源性[16]。

李建武[17]采用SSH技术构建了富集黄瓜霜霉病抗性相关基因的正、反向差减文库，应用反向Northern斑点杂交技术进行筛选，从正、反向差减文库中分别得到了60和26个非重复序列片段(singleton ESTs)，其中，正向差减文库的singleton ESTs涉及12种功能类别和未知功能，比较分析发现，反向差减文库与正向差减文库相比，下调显著表现在有更多的能量代谢和次级代谢相关基因，说明在霜霉病病原菌胁迫下，黄瓜参与次级代谢和能量代谢基因的表达更多地受到了抑制或破坏。

刘大军[18]利用SSH技术构建抗病黄瓜材料接种霜霉病菌和未接种差异表达的消减cDNA文库。经反向Northern blot杂交检测，共得到48个阳性克隆、14个UniESTs，包括8个singletons和6个contigs，找到了与之匹配的同源序列有10个EST片段，推测其余未找到同源序列的EST片段可能是新基因，RT-PCR，试验和实时定量RT-PCR，结果表明，Csa001907和Csa002921在抗病品种中有可能是黄瓜抗霜霉病的R基因，证明了大部分R基因是组成型表达的，且在抗病品种中存在下调表达现象，通过实时定量RT-PCR试验表明，Csa001907和Csa002921在感病品种中不存在下调表达现象。刘大军等[19]研究发现，在黄瓜基因组中与拟南芥抗霜霉病基因存在185个同源R基因，有2个与甜瓜的抗霜霉病基因At1和At2同源的R基因，通过聚类分析将这些基因分为6类，初步认定Csa001907和Csa002921为黄瓜抗霜霉病的R基因，且在叶片组织中有一定表达量，其表达量减少可引发黄瓜品种的抗病反应。

李佩芳[20]采用实时荧光定量PCR，以EF1-α和UBI-ep为内标基因，探讨黄瓜抗霜霉过程与相关抗性基因的关系，发现抗病自交系HNAU-0023防御基因PR-1、MT、PIP、Danj和CAT，信号转导因子MAPK1，转录因子TR、WRKY60、TF和WRKY30相较于感病自交系IL112，表现为上调表达，表明这些基因在一定时间段可能参与了黄瓜过敏性抗病反应，GNRF可能未参与黄瓜过敏性抗病反应，喷施胼胝质抑制剂DDG和H2O2抑制剂DPI/DMTU 6 h后接种霜霉病菌，相较于清水对照，抗病自交系HNAU-0023的防御基因PR-1、PIP和MT，转录因子TR、TF、WRKY60、WARKY30和MYC，信号转导因子RBOH和MAPK1表现为下调表达，说明抑制剂DPI/DMTU/DDG可有效地抑制前期高效上调表达抗性基因下调表达，同时证实这些抗性基因参与了过敏性抗病反应，可能是黄瓜抗霜霉病过程中的关键调控基因。

刘大军等[21]分析了SSH-EST代表的基因功能，发现叶绿体的重建和保护机制和抗氧化胁迫能力与抗病品种抗病能力密切相关，同时，提出可能参与了R基因介导的防御反应有SSH-EST代表的clpb、HSP70、HSP22和肽脯氨酰顺反异构酶，R蛋白的“保卫靶”可能是smHSP，负责监测细胞内的异常，该发现提供了关于揭示活性氧机制和R基因介导的防卫机制之间关系的关键证据。李晓辉[22]通过qRT-PCR分析结果表明，黄瓜抗病品种HNAU-0023离体叶片在接种霜霉病菌48和72 h后CsFBXL基因的表达量显著下调，而在诱导24 h时感病自交系112显著上调表达，这暗示CsFBXL基因具有组织特异性表达的同时可能对黄瓜霜霉病过敏性抗病反应存在负调控，在不同激素(ABA、SA、JA)诱导下，前期表达量均较弱，CsFBXL基因在24 h时在ABA、SA诱导下显著表达，JA的表达量次于二者，因此，推测ABA、SA、JA激素诱导的信号转导调控可能有黄瓜泛素CsFBXL基因的参与。

目前，实时荧光定量PCR应用广泛，定量极微量的基因表达或DNA拷贝数通过此技术与其他分子生物学技术相结合成为可能，且荧光定量PCR技术、荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的应用发展，使定量PCR技术在临床疾病的诊断和治疗方面可能有帮助。SSH是结合了抑制性PCR和消减杂交技术的快捷、有效的差异基因筛选方法，比传统的DD-PCR、SAGE及cDNA-RNA等技术假阳性低、低丰度mRNA富集效率高、灵敏度高、重复性好等，广泛应用于动植物发育与分化、微生物基因分型差异、疾病易感性差异、病理和正常样本方面的抗药性差异和组织差异的研究。

6　问题与展望

6.1增加分子标记类型，加速优良新品种的选育进程在抗病基因的分子标记方面虽达到了理想距离，但目前用于黄瓜遗传与育种研究中的分子标记主要是SSR、AFLP和RAPD标记，与其他植物相比，获得的分子标记类型相对较少。为加速黄瓜优良新品种的选育进程，扩展黄瓜种质资源的遗传多样性和重视黄瓜基因表达及调控等方面的研究，克隆主要经济性状基因并开发相关廉价快捷的分子标记方法非常必要。

6.2培育高抗黄瓜霜霉病品种应用于实际生产在黄瓜抗霜霉病基因方面，对于抗霜霉病相关基因的功能验证方面相对复杂，研究相对较少，筛选更为精确的黄瓜抗霜霉病相关基因、利用其优化黄瓜遗传转化体系是黄瓜抗霜霉病研究的重点和难点，分离黄瓜抗霜霉病相关基因，利用分子育种手段培育高抗黄瓜霜霉病品种，打破效率和成本因素，应用于实际生产中，是黄瓜霜霉病分子生物学研究的实际目标。

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New Progress in Molecular Markers and Related Genes of Cucumber Downy Mildew

ZHANG Zhi, WANG Qi-qi, HE Dong

(College of Life Sciences and Agriculture and Forestry, Qiqihar university, Qiqihar, Heilongjiang 161006)

Research progress of the molecular biology of cucumber downy mildew was reviewed from the aspects of the characteristics, occurrence regularity, molecular marker, pathogen of cucumber downy mildew, related isolation and identification of downy mildew gene. The direction of future research was forecasted.

Cucumber downy mildew; Gene; Molecular marker; Cloning

黑龙江省教育厅科学技术研究项目“钾对高寒地区设施黄瓜生长影响的研究”(11551538)。

张志(1966- )，男，黑龙江海伦人，副教授，硕士，从事生物遗传学方面的研究。

2016-05-26

S 436.421.1+1

A

0517-6611(2016)18-120-03