家蚕微孢子虫诊断方法研究进展

曹琛福， 林彦星， 吕建强， 花群义

(深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045)



家蚕微孢子虫诊断方法研究进展

曹琛福， 林彦星， 吕建强， 花群义

(深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045)

摘要自家蚕微粒子病被发现近200a来，它给世界各养蚕国家造成巨大的经济损失，已被列为蚕种生产的唯一检疫对象。为了更好地了解并总结家蚕微孢子虫现有的诊断方法及其研究进展，该研究主要对近些年来在光学显微镜检测、电镜观察检测、免疫学检测和分子生物学检测方面的研究进行了综述，并且展望未来发展趋势，以期对家蚕微粒子病进行更快速、准确的诊断与防治。

关键词家蚕微孢子虫；诊断；方法

家蚕微粒子病是由微孢子虫(Microsporidia)寄生而引起的一类蚕的传染性原虫病。微孢子虫是专性细胞内寄生的真核生物，广泛寄生于昆虫等无脊椎动物及哺乳类、鸟类、鱼类等脊椎动物体内，至今已被发现的微孢子虫达150属、1 200种以上[1]。家蚕微孢子虫(Noesmabombycis)属于真菌界微孢子虫门微孢子虫纲微孢子虫目。1857年Nageli首次从病蚕中鉴定出家蚕微孢子虫[2]，由于它既可以食下传染又可以胚胎传染，对蚕业养殖造成致命的损害。1845年，法国Vaucluse洲首次暴发家蚕微粒子病，随后迅速蔓延到欧洲其他蚕区，给19世纪的欧洲养蚕业带来毁灭性打击，后来微粒子病又传播到日本和中国等亚洲国家，给这些国家的养蚕业造成巨大的经济损失。世界各养蚕国家和地区都将其列为蚕种生产的唯一检疫对象，也成为蚕业界研究的重点和难点。

1986年我国农牧渔业部动物检疫所将家蚕微粒子病列入《动物检疫》目录，之后相继发布农业行业标准《桑蚕一代杂交种检验规程》(NY/T327-1997)、《桑蚕原种检验规程》(GB19178-2003) 和国家标准《桑蚕原种》(GB19179-2003)，2014年又发布出入境检验检疫行业标准《家蚕微粒子病检疫技术规范》(SN/T 4292-2015)。这些标准对家蚕微粒子病的检验检疫进行了规范。笔者对家蚕微粒子病病原的主要检测技术、诊断方法和最新的研究进展进行综述。

1光学显微镜检测家蚕微孢子虫

自Louis Pasteur创立母蛾镜检法100多年以来，在蚕业生产实践中一直沿用普通光学显微镜镜检法(母蛾镜检法)来诊断家蚕微孢子虫，但其存在很多不足。首先，该方法只能以中间产品母蛾作为检验对象；其次，该方法需依赖有经验人员实施检验，易与母蛾样本中的绿僵孢子、曲霉孢子、花粉粒等混淆。在实施镜检时，常用的染色方法有姬姆氏染色、革兰氏染色。在此基础上，研究人员采用多种特殊染色法来鉴定微孢子虫。唐顺明等[3]应用高锰酸钾-甲基紫法将家蚕微孢子虫染成紫色，而绿僵孢子、曲霉孢子则呈紫褐色，花粉粒呈淡黄色块状，从而能快速地鉴别家蚕微孢子虫和其他干扰物。Ignatius等[4]采用抗酸的三色染色法将微孢子虫染成粉红色，从而将真菌、细菌及粪样区别开来。牛安欧等[5]采用韦伯氏Chromotrop染色法将比氏肠微孢子虫、肠脑炎微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫及兔脑炎微孢子虫等染成红色，而细菌和粪渣等染成绿色。刘吉平等[6]用Calcofluor M2R染色法染色后，在荧光显微镜下可见家蚕微孢子虫发出强烈的青蓝色荧光，病毒多角体和细菌不被染色，真菌孢子染色后的荧光相对较弱，可有效地对形状相似物进行鉴别。采用多种染色法镜检，可提高检测的敏感性。虽然采用这些方法可以很好地与其他孢子及杂物相区分，但染色法不能鉴别孢子虫的具体种属[7]，对微孢子虫种属特异性的鉴别仍需借助电子显微镜、现代免疫学和分子生物学的技术和手段[8]。

2电子显微镜检测家蚕微孢子虫

成熟微孢子虫主要由孢子壁(Sporewall)、孢原质(Sporoplasm)、发芽装置(Extrusion apparatus)和孢子细胞器(Organelle)等组成[9]。孢子壁厚而坚硬，由3层结构组成，由外入内依次为刺突状外层孢子外壁(Exospore)、透明薄层孢子内壁(Endospore)和纤维性内层的原生质膜(Plasmamembrane)[10-11]。孢子外壁由致密的淀粉纤维状的蛋白质基质组成；孢子内壁由壳多糖和蛋白质组成，厚而均一，分别与孢子外壁和孢原质膜相连；原生质膜则将孢子壁与内部的孢原质隔开。孢原质的前部是由平滑的薄膜层叠成的极膜层，孢原质的后部有沿孢子短轴方向稍伸长的孢子。发芽装置主要由孢子壁内侧螺旋状盘绕的极管、若干叠成片状的薄膜层、结构相对松散的极膜层和由多层膜包围成的后极泡构成，极膜层可分为紧密和疏松两个形态不同的前后部分。孢子细胞器主要由内质网(Endoplastic reticulum)、极膜层结构(Polaroplast)、高尔基体(Golgiosome)和高度简化的线体(Mitosome)等组成[12]。家蚕微孢子虫的成熟孢子大小为(3.6~3.8)μm×(2.0~2.3)μm，呈卵圆形，表面光滑且折光性较强。家蚕微孢子虫的极管前端与孢子纵轴呈平行状，后端沿孢子壁与纵轴形成螺旋状卷曲。它在感染的过程中存在2种形态的感染体即长极丝孢子和短极丝孢子，其中长极丝孢子的极管圈数一般为12~14圈，13圈居多，极丝倾斜角一般为52°[13]。

3免疫学方法检测家蚕微孢子虫

3.1微孢子虫蛋白质组学采用一维和二维蛋白电泳技术对微孢子虫的蛋白成分、蛋白组成进行分析，同时对微孢子虫进行识别、分类和鉴定。1982年Streett等[14]利用SDS-PAGE技术区分家蚕微孢子虫和变形微孢子虫。1989年梅玲玲等[15]从蛋白质氨基酸组成上发现家蚕微孢子虫和桑尺蠖来源的微孢子虫基本相同。1999年高永珍[16]通过电泳图谱发现家蚕微孢子虫的谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸含量要比其他微孢子虫高。2004年黄少康等[17]利用双向电泳技术发现家蚕微孢子虫和内网虫属样微孢子虫的蛋白点差异明显。党晓群等[18]利用质谱技术及序列分析发现微孢子虫的亮氨酰氨肽酶和丝氨酸蛋白酶在兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫中的相似度较高，其进化较保守。

微孢子虫孢壁蛋白的成分和特性可被应用于微孢子虫的分类和检测上。赵唯希[19]鉴定了家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5、SWP8、SWP12、SWP26、SWP30、EOB14207.1，认为它们可能成为微孢子虫检测和抗微孢子虫药物设计的新靶标。河原烟勇等[20]比较了8种微孢子虫的表面蛋白，证实它们可以作为微孢子虫的分类依据，其中包括热休克蛋白。Peyretaillade等[21]也获得小孢子虫和脑炎微孢子虫的HSP70基因的“同系物”。极丝蛋白主要有PTP1、PTP2、PTP3，与孢子的侵染作用密切相关，这可能会给微孢子虫的诊断和治疗带来新的发展空间[22]。高永珍[16]从家蚕微孢子虫和蓝萤叶甲微孢子虫中抽提了极丝蛋白进行SDS-PAGE的比较，发现这2种孢子虫孢子极丝蛋白的电泳图谱基本相同，都含有多条蛋白带，并且都有33 kD的主带。

3.2家蚕微孢子虫免疫学检测检测技术包括免疫测定法、间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验、对流免疫电泳和蛋白印迹分析等[23]。郭广清[24]利用发芽液制备单克隆抗体来鉴定家蚕微孢子虫，还针对家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP32制备单克隆抗体，结合免疫层析技术制备胶体金免疫试剂条，其检测灵敏度达8.0×106个/mL。李艳红等[25]通过制备家蚕微孢子虫总蛋白多克隆抗体，建立免疫荧光检测家蚕微孢子虫的方法(IFA)。该方法具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便等特点。万淼[26]建立了双抗体夹心ELISA检测家蚕微孢子虫的方法，对纯化孢子的检测最低量为 3.125×105个/mL，对“添毒”蚕卵的检测最低量为 5.000×106个/mL。陈祖佩等[27]采用家蚕微粒子虫致敏碳素凝集法检测母蛾微孢子敏感性，发现它明显高于显微镜检测技术对家蚕微粒子虫的检测。万嘉群[28]分别采用酶标抗体间接法和酶标抗体 PAP 法检测家蚕微粒子虫孢子。

4分子生物学检测家蚕微孢子虫

4.1家蚕微孢子虫核酸分子杂交诊断技术韦亚东等[29]根据家蚕微孢子虫的核糖体RNA基因高度保守的特点，采用原位杂交技术将标记的探针在组织和细胞水平鉴定目标核酸的存在，从而对家蚕卵和幼虫体内感染的家蚕微孢子虫进行早期诊断。然而，这些方法由于操作复杂、耗时和需要较高档的仪器设备，很难在生产上大面积推广和运用。邱宝利等[30]利用核酸点杂交和Southern杂交技术，用1对家蚕微孢子虫特异性引物(上游引物：5′-AGTGAATGTAGGAGGAGTAGAAAGAGGC-3′，下游引物：3′-GCGCAACTCATAATGGTTCGTCCTGTTT- 5′)[31]成功地从蚕业生产中流行的10多种病原性微孢子虫中鉴定出来。采用特异性探针与SSU rRNA序列进行原位杂交，也检测出艾滋病病人感染的拜氏微孢子虫[32]。

4.2家蚕微孢子虫普通PCR检测方法目前，采用PCR方法检测家蚕微孢子虫时，主要针对家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNS基因来设计特异性引物。陈秀等[33]根据家蚕微孢子虫和变形微孢虫的SSU rRNA 基因序列分别设计2对特异性引物，对家蚕微孢子和其他家蚕病原性微孢子虫进行 PCR 诊断。刘吉平等[34]根据家蚕微孢子虫及其相近种属微孢子虫的SSU rRNA 保守区域设计了1对引物V1F/530R。该引物对纯家蚕微孢子虫孢子 DNA模板的检测敏感度达到 3×104个/mL，对模拟感染家蚕微孢子虫孢子的蚕蛾 DNA 模板的检测敏感度高达 3×105个/mL，两者均达到或超过目前生产上使用的显微镜检测灵敏度。何永强等[35]也利用家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因鉴别、检测家蚕微孢子虫。Hatakeyama等[36]分别从感染家蚕微粒子病原虫的蚕卵和家蚕中抽提基因组 DNA作为模板，用多引物 PCR扩增特异的 DNA 序列，验证多引物 PCR 可以实际应用于同时感染几种能导致家蚕微孢子病的微孢子虫的早期检测，对蚕卵微粒子病的诊断研究具有实用价值。

4.3家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法实时荧光定量PCR技术在微孢子虫核酸定量检测中也有很多应用的实例[35,37-39]。 何永强等[40]以家蚕微孢子虫SSU rRNA基因长度为66 bp的片段作为靶标，设计特异性引物和TaqMan探针，成功构建检测家蚕微孢子虫的实时荧光PCR方法，并且研制出诊断家蚕微孢子虫的试剂盒。Bourgeois等[37]采用荧光定量PCR方法在样本差异低的情况下对东方蜂微粒子虫进行检测和定量分析。Polley等[38]研发了一种仅使用SYBR Green实时PCR方法，实现对感染多种微孢子虫的粪便样品同时检测和种属鉴定，有17种阳性样品通过荧光定量PCR检测方法分析，其中14种感染比氏肠微孢子虫、2种感染具褶孢虫属孢子虫、1种感染兔脑炎微孢子虫。上述分子生物学方法在灵敏度和特异性方面比传统的显微镜检法有很大的优势。

4.4家蚕微孢子虫环介导等温扩增技术(LAMP)检测技术LAMP是近年来建立的一种新的核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、快速简便且成本低廉等优点。燕薇[41]运用LAMP法检测家蚕微孢子虫，最低检测极限为10个孢子/mL，可有效区分感染家蚕的主要致病细菌(灵菌、苏云金杆菌)和真菌(白僵菌、绿僵菌、曲霉)。对感染微粒子病的家蚕进行早期诊断时，应用LAMP技术比常规的显微镜检查提早24 h左右。

目前，在诊断家蚕微孢子虫时，除了选择家蚕微孢子虫的蛋白或核酸作为靶标，也有学者尝试通过比较感染微孢子虫的家蚕(卵)与未感染微孢子虫家蚕(卵)的差异蛋白为检测靶标。龚娟娟[42]发现，家蚕低分子量Lip 30 kD蛋白在感染了微孢子虫的蚕卵中的表达量比未感染蚕卵中的表达量高3倍。

5展望

对家蚕微孢子虫的诊断方法的研究主要包括光学镜检、电镜检查、免疫学技术、分子生物学技术等。光学镜检是较古老且经典的检测方法，但是一般需要在感染晚期才能观察到，对防治起不了太大的作用。电镜检查必须经过超薄切片、电镜观察，对设备和操作人员的技术要求较高，目前主要用于科研。免疫学的方法多数是用家蚕微孢子虫蛋白进行免疫获取相应的多克隆抗体或单克隆抗体，其准确性较高，灵敏性也好，但由于对其结构蛋白研究不够深入，在鉴别各属微孢子虫时较为困难。分子生物学技术凭借其特异、灵敏、操作简便等优势，近年在鉴别家蚕微孢子虫方面研究比较活跃，但其检测也需要在实验室条件下才能完成。总之，这些方法虽然有各自的优点，但都存在一定的缺陷，很难在基层生产上推广。因此，研究人员需要更多地发掘家蚕微孢子虫特异性结构蛋白，结合单克隆抗体技术研制出诸如胶体金试剂条等既快速、简便、高效又能够在基层广泛使用的检测方法，或利用分子生物学技术研制适合现场的快速、灵敏、准确的方法。

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Research Progress of Diagnosis ofNoesmabombycis

CAO Chen-fu, LIN Yan-xing, LV Jian-qiang et al (Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Centre, Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen, Guangdong 518045)

AbstractSince the discovery of pebrine disease nearly two hundred years ago, pebrine disease has caused serious damage to the world’s sericulture country.It is the only quarantine object of the silkworm eggs in the sericulture countries and regions.In order to better understand and summarize the diagnostic method ofNoesmabombycisand its research progress, we reviewed the researches on optical microscopic microscopy detection, electron microscope inspection, immunology and molecular biology detection in recent years.The future development was forecasted in order to rapidly and accurately control and diagnose theNoesmabombycis.

Key wordsNoesmabombycis; Diagnosis;Method

收稿日期2015-12-16

作者简介曹琛福(1977- )，男，江西南康人，高级兽医师，博士，从事动物及其产品的检验检疫工作。

基金项目国家质检总局科研项目(2013IK042)。

中图分类号S 884.2+1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)02-001-03