D-半乳糖对大鼠血清同型半胱氨酸含量及血管病理变化的影响

李允江，毕云生，张淑瑜，于燕莉

基础医学

D-半乳糖对大鼠血清同型半胱氨酸含量及血管病理变化的影响

李允江，毕云生，张淑瑜，于燕莉

目的 研究D－半乳糖致大鼠衰老后血清同型半胱氨酸（hcy）的变化，并与正常鼠血管结构组织比较。方法采用皮下注射D－半乳糖的方法制备大鼠衰老模型（n=10），另设10只为正常组。采用AU5800全自动生化检测仪测定血清中hcy的含量，运用SPSS16分析hcy含量差异与正常组比较。结果hcy含量在两组间差异显著（6.7700±0.30203 vs 12.8400±0.62039 E2/mg·ml，P＜0.05）；模型组对血管引起正常组所没有的较大变化。结论D－半乳糖能升高衰老大鼠血清中的hcy含量，并可改变血管的病理学指数。

D－半乳糖；血清；同型半胱氨酸（hcy）；病理学变化

D－半乳糖衰老动物模型目前已被众多国内外学者肯定和接受，该造模方法比其他几种衰老模型得到的结果更加稳定，但是，目前对于其致衰机制还不是特别清楚，不同文献的检测指标也各有差异。秦红兵等［1］研究发现D－半乳糖建立衰老模型能够使小鼠的记忆功能出现下降，增加氧自由基产物的含量，降低机体的抗氧化能力以及降低小鼠的免疫功能，得出此模型可用于行为学、抗氧化，以及免疫等方面的抗衰老药效研究。但是还没有研究显示此模型对血清中同型半胱氨酸（hcy）的影响。杨惠聪等［2］研究发现hcy是动脉粥样硬化的危险因素，并且与冠状动脉粥样硬化病变程度呈正相关。王三敏［3］发现hcy是颈动脉粥样硬化的独立危险因素。张琛涛［4］研究发现冠心病血管病变支数和狭窄程度与血浆Hcy水平具高度相关性，病变程度越重、病变支数越多，血浆hcy水平越高。Wald等［5］研究发现血浆中的同型半胱氨酸含量与心血管疾病的发生成正相关。李艾帆［6］研究发现高hcy血症是河南汉族脑梗死的独立危险因素。任应鹏等［7］研究发现hcy是独立于T－chol以外的心脑血管疾病危险因子。所以说hcy目前已被广泛证明是一种独立的心脑血管疾病风险的预测因子。随着经济社会的发展，医疗水平的提高，我国人口平均寿命不断提高，老龄化问题日趋严重，目前我国老年人口在增速和数量上均为全球第一。联合国的最新预测显示，在21世纪中期，中国60岁（包含60岁）以上老人占总人口的比重将达到36.5%这一历史新高，届时将高于美国等绝大部分发达国家。然而心脑血管方面的疾病是一个威胁老龄人口健康的重要疾病，心脑血管疾病在老年人中的死亡率占首位。所以说有效预测心脑血管疾病显得尤为重要，但是目前还没有报道D－半乳糖衰老大鼠血清中hcy的报道，笔者拟对其进行检测，并将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠20只，SPF级，体重180～210 g，购买自山东大学实验动物中心（动物合格证号：SCXK（鲁）2013-0009）。饲养在济南军区总医院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 D-半乳糖 （20141021，购自张家港市思普生化有限公司）、AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）、B600A型医用低速离心机（河北省安新县白洋离心机厂）、水合氯醛（规格：30 ml∶3 g，济南军区总医院药剂科制剂室自制，批号：20141221）和多聚甲醛溶液（自配）。

1.2 方 法

1.2.1 衰老大鼠模型的建立 将20只雄性Wistar大鼠按体重随机分成两组，正常组和模型组。先适应性饲养1周，对照组10只，每只背部皮下注射生理盐水1 ml/100 g·d，模型组10只，每只背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg·d，每周进行一次体重测量，根据新的体重对生理盐水和D-半乳糖的注射剂量进行调整，连续45 d，完成衰老模型的建立。

1.2.2 指标检测 造模结束后，对所有大鼠禁食12 h，不禁水，12 h后大鼠用水合氯醛麻醉取静脉血置于真空取血管中，轻微晃动使抗凝药与血液混合充分后静置片刻后于3000 r/min离心10 min，用液枪分离血清和血浆，分别置于Ependoff管保存在-80℃的超低温冰箱中备用，取各血清适量于全自动AU5800生化测定仪测定hcy的含量。胸主动脉取出后小心剔除脂肪组织，避免破坏血管的组织结构，浸泡于多聚甲醛溶液中进行固定，保存于4℃的冰箱中以备做病理切片。对血管内中外膜进行HE染色，在光镜下观察组织病理学的改变。

1.2.3 统计学方法 运用SPSS16统计学软件对实验数据进行分析，结果数据以表示，采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05认为有显著性差异。

2 结果

2.1 血清中hcy含量的测定 两组间存有显著性差异 （6.7700±0.30203 vs 12.8400±0.62039 E2/mg· ml，P＜0.05）。D-半乳糖衰老大鼠模型的血清hcy含量明显比正常组高。说明D-半乳糖能够使大鼠血清中的hcy含量升高。

2.2 血管病理组织切片检查 模型组胸主动脉血管在镜下可以看到血管管腔不规则，局部血管壁增厚，部分内皮细胞肿胀，局部内皮细胞脱失，血管内膜及管壁水肿并伴有少量炎性细胞浸润，血管壁纤维组织及平滑肌出现增生的现象。说明D-半乳糖对血管的结构功能产生了较大影响，并与hcy的高水平相互佐证。而正常组的血管管腔很规则，内皮细胞也未见肿胀，内膜光滑，未见脂质沉淀，血管膜及血管壁未见纤维组织及平滑肌的增生，没有炎性细胞浸润的现象。见图1。

图1 两组大鼠血管病理组织切片结果比较

3 讨论

心脑血管疾病是指血液黏稠、动脉粥样硬化、高脂血症、高血压等因素所导致的心和大脑以及全身组织发生缺血性或出血性的疾病，通常统称为心血管疾病和脑血管疾病，是当前严重威胁人类健康和生命的疾病之一［7］。Wald等［5］研究显示血浆hcy水平和血管危险性之间呈剂量依赖关系，即hcy每升高5 μmol/L，脑卒中风险升高59%，缺血型心脏病风险升高32%，Hcy每降低3 μmol/L，脑卒中风险降低24%，缺血型心脏病风险降低16%，呈明显的正相关。同型半胱氨酸（homocysteine，hcy）是蛋氨酸代谢过程中的中间产物，其有两种存在形式，一种是含二硫基的氧化型，一种是含硫基的还原型，但是还原型只占极少数部分。

胆固醇和心脑血管疾病的紧密联系已经与现在越来越多的临床案例不相符合，有一半以上的心脑血管疾病患者的血常规检验报告显示他们的胆固醇并不高。对于心脑血管疾病的危险因素有些是非人为可以改变的，比如性别，遗传等因素，目前可以干预的危险因素有高脂血症，高血压等，但并不是每个心脑血管疾病患者都存在这些症状，有些心脑血管疾病患者并不具备这些症状，所以寻找新的、准确的心脑血管预测风险因子显得非常必要。

hcy是人体生命活动代谢的正常产物，当人们食用含蛋氨酸的蛋白质后，就会通过体内的蛋氨酸代谢途径生成，是谷胱甘肽以及S-AMe生成的中间产物。其中S-AMe是人体内良好的甲基供体，是一种不可或缺的生命物质，能够保证体内的生化反应按照正确而有效的方式进行。也就是说食用的蛋氨酸先转换为hcy，再经过一系列的生化反应转化为谷胱甘肽和S-AMe。但是一旦机体由于种种原因而缺乏维生素B族的一些元素，叶酸以及个别金属元素比如锌等，就会使生化反应的某些环节因缺少反应物而无法完成正常的转化过程，利用hcy的反应受到影响，就会使体内hcy含量升高，由于生成谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的途径受到阻碍，它们在体内的含量因此而降低。然而Umphrey等［8］研究证明hcy是心脑血管疾病危险的始动因子。高hcy能够损伤血管内皮功能，产生炎症反应。郭雪微等［9］研究发现随着hcy水平增高，血白细胞表面黏附分子CD11b、CD18表达明显增加，从而增加炎性反应。本实验的胸主动脉血管病理组织切片的特征也与此相符。至于产生脂质过氧化作用，谷兆侠等［10］研究发现hcy能够刺激氧化应激反应而造成体内脂质过氧化物含量的升高。之前的研究证明D-半乳糖致Wistar大鼠衰老模型的方法能够升高大鼠体内SOD，MDA的水平，并与其他学者的报道相符。Cui等［11］研究发现D-半乳糖是一种机体本身就含有的代谢产物，当注射一定剂量的半乳糖后，原有的代谢途径无法及时有效地利用D-半乳糖，就会造成大量D-半乳糖堆积在细胞内，不能通过eLilo和醛糖还原酶通路及时代谢，过量的D-半乳糖就会在半乳糖氧化酶作用下，生成醛类、H2O2以及超氧阴离子，从而对机体产生损伤。这一代谢机制是D-半乳糖致衰的机制，也是其优点，利用机体本身具有的代谢中间产物干预机体的生命活动不会产生额外的损伤，显示出了良好的造模方法。肖航等［12］研究发现用含10 g/L的D-半乳糖培养基培养出生3 d内SD乳鼠纯化的心脏成纤维细胞72 h后，发现D-半乳糖能缩短SD乳鼠心脏成纤维细胞端粒的长度。伴随着基因的复制，细胞生长繁殖，宏观上就是人年龄的增长，端粒的长度在不断的缩短，当短到一定程度时则无法完成细胞的复制，生命体就会随之结束。刘克明等［13］研究发现D-半乳糖导致的大鼠衰老模型虽然某些指标接近自然衰老的大鼠，但是很多方面（比如免疫力，行为等）与自然衰老的大鼠相比还存在较大的差异。D-半乳糖模型鼠是由化学损伤造成的，难以真实反映衰老的生理生化改变。因此D-半乳糖模型鼠可能不宜应用于免疫、行为等方面的衰老研究。也就是说D-半乳糖只适用于部分衰老的研究，本课题的目的就是证明D-半乳糖能否提高大鼠血清中hcy的水平以便进而用此模型进行血管抗衰老研究，因为hcy是心脑血管疾病的独立风险预测因子，但是目前还没有实验证据显示D-半乳糖能够升高hcy的水平。

该实验采取的是医院临床上常用的生化分析仪，对临床监测更具有现实意义，全自动生化分析仪相比高效液相色谱法具有显著的优点，迅速，准确，并且能有效地避免人为操作误差。本实验的研究结果证明D-半乳糖能够提高大鼠血清hcy的水平，并且胸主动脉血管病理组织表现出了一系列的病理特征，从组织上佐证了这一结论。提示D-半乳糖致大鼠衰老模型可以用来做血管衰老的实验研究，并且可以用hcy的水平为指标。

［1］秦红兵，杨朝晔，范忆江，等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立和评价［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（7）：1275-1278.

［2］杨惠聪，吴阿阳，林 洁，等.血浆中CRP、Hcy、LDL、HDL含量与动脉粥样硬化的相关性研究［J］.检验医学与临床，2011，20（8）：2433-2437.

［3］王三敏.hcy、mif与颈动脉粥样硬化相关性研究［D］.蚌埠：蚌埠医学院，2013.

［4］张琛涛.HCY与冠心病、高血压病的相关性研究［D］.桂林：桂林医学院，2013.

［5］Wald DS，Law M，Morris JK.Homocysteine and cardiovascular disease：evidence on causality from a meta-nalysis［J］.BMJ，2002，325（7374）：1202.

［6］李艾帆.hcy及其代谢关键酶基因多态性与河南汉族脑梗死的相关性研究［D］.郑州：郑州大学，2014.

［7］冯变玲.基于数据挖掘技术的心脑血管用药ADR关联模型构建研究［D］.天津：天津大学，2012.

［8］Umphrey LL，Fu R Rogers K.Homocy steine level and coronary heart disease incidence：asystematic review and meta-analysis［J］. Mayo Clin Proc，2008，83（11）：1203-1212.

［9］郭雪微，王雪里红，杨 泉．同型半胱氨酸与白细胞黏附分子CD11b、CD18关系的体内外研究［J］．中国心血管病研究，2008，6（12）：888－891．

［10］谷兆侠，张俊河，张 煜，等．同型半胱氨酸促氧化作用机制探讨［J］．医药论坛杂志，2008，29（5）：16－18．

［11］Cui X，Wang L，Zuo P，et al.D-galactose-caused life shorten-ing in Drosophila melanogaster and Musca domestica is associated with oxidative stress［J］.Biogerontology，2004，5（5）：317－325.

［12］肖 航，刘 玮，孟 刚，等.D－gal对鼠成纤维细胞端丽长度的影响［J］.第三军医大学学报，2006，28（9）：982－983.

［13］刘克明，王春花，李国星，等.D－半乳糖模型鼠与自然衰老鼠的比较研究［J］.卫生研究，2007，36（6）：685－688.

［2016－03－12收稿，2016－04－10修回］ ［本文编辑：韩仲琪］

In
fluence of D-galactose on serum hcy levels and vessel pathological changes of rats

LI Yun－jiang①，BI Yun－sheng，ZHANG Shu－yu，et al.①Shandong University of TCM and Materia Medica，Jinan，Shandong 250000，China

Objective To study the changes of serum hcy of aging rats induced by D－galactose，and explore the influence of it on pathological exchanges of vessels.MethodsThe rat aging model was made by subcutaneous injection of D－galactose（n=10，as model group）；other 10 rats were selected as normal control group. The content of hcy in serum was detected by AU5800 automatic biochemical analyzer.By using SPSS16 the difference of hcy content was compared between two groups.ResultsSignificant difference possessed between two groups（P＜0.05）in hcy content（6.7700±0.30203 vs 12.8400±0.62039 E2/mg·ml）.While，the pathological changes of vessels in control group and model group also provided relevant proof.ConclusionD－galactose could increase the content of hcy in serum of aging rats，and make vessels resulting in pathological change.

D－galactose；Serum hcy；Pathological change

R339.34：C913.6

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.09.022

250000山东济南，山东中医药大学 ［李允江 （在读硕士）］；250031山东济南，济南军区总医院（李允江，毕云生，张淑瑜，于燕莉）

于燕莉，Email：yuyanli323@sohu.com