酸性微环境促进前列腺癌细胞PC-3迁移并活化Rac1蛋白

高 漓，谭 宁，张天禹，何小龙，郭维杰，张振锋，查若朋

酸性微环境促进前列腺癌细胞PC-3迁移并活化Rac1蛋白

高 漓1，谭 宁2，张天禹1，何小龙1，郭维杰3，张振锋3，查若朋3

目的探讨肿瘤外周酸性微环境对PC-3前列腺癌细胞迁移的影响，并探讨其可能的作用机制。方法将PC-3前列腺癌细胞分别培养在不同pH（7.4、7.0、6.6）的细胞培养基中，通过体外实验，分析PC-3细胞在侵袭、迁移等转移能力上的改变；对细胞骨架肌动蛋白Actin进行染色，通过激光共聚焦显微镜观测肿瘤外周酸性微环境对细胞骨架肌动蛋白聚合的影响；通过Western blot实验，检测肿瘤外周酸性微环境对PC-3前列腺癌细胞Rac1蛋白活化的影响。结果当肿瘤外周微环境向酸性变化时，PC-3细胞的侵袭及迁移能力均显著增强（P＜0.01）；激光共聚焦显微镜观测结果提示，肿瘤外周酸性微环境促进细胞骨架肌动蛋白的聚合；Western blot检测结果显示，肿瘤外周酸性微环境促进PC-3细胞Rac1蛋白的活化。结论肿瘤外周酸性微环境对PC-3细胞迁移的促进作用与Rac1蛋白活化密切相关。

酸性微环境；前列腺癌；迁移；肌动蛋白；Rac1

前列腺癌是威胁男性健康的常见肿瘤之一，2008年调查数据显示，其发病率和死亡率分别位居全球男性全部恶性肿瘤的第2位（14%）和第6位（6%）［1］。虽然与发达国家相比，中国仍是前列腺癌的低发国家，但近年来随着中国人口老龄化步伐的加快、前列腺癌诊疗水平的提高和生活方式的转变等多种原因，中国前列腺癌发病和死亡均呈明显上升态势［2］。前列腺癌转移是前列腺癌患者死亡的主要原因，对于已经转移的前列腺癌，往往难以通过手术及放疗等治疗来获得理想的治疗效果。前列腺癌的转移与否，对前列腺癌治疗效果及预后有决定性的影响。研究［3］显示，肿瘤的转移是一个相互关联的多步骤的过程，包括原发癌的扩展、肿瘤血管生成、肿瘤细胞脱落并在黏附基质后侵袭、肿瘤细胞进入脉管系统迁移、转移癌栓的形成、在继发组织器官定位生长、以及转移癌继续扩散等。肿瘤的转移不仅取决于肿瘤细胞自身的特性，如肿瘤转移相关基因的活化及失活；还涉及到肿瘤细胞与肿瘤微环境间的相互作用，如肿瘤细胞与巨噬细胞［3］，肿瘤细胞与肿瘤基质中的血管内皮细胞、纤维母细胞［4］，肿瘤细胞与肿瘤酸性微环境等［5］。该研究通过将前列腺癌细胞PC-3培养于不同pH（7.4、7.0、6.6）的细胞培养基中，以观察细胞外周酸性微环境对PC-3细胞转移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料前列腺癌PC-3细胞株购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自美国Gemini公司（Cat No.900-208）；DMEM购自美国Gibco公司（Cat No.12430-047）；Alexa FluorR 594 phalloidin购自美国lifetechnologies公司（Cat No.A12381）；Rac1活性检测试剂盒（Cat No.17-441）购自美国Millipore公司；β-actin（Cat No.sc-47778）购自美国Santa Cruz公司；ECL发光底物试剂盒购自美国Pierce公司；Transwell小室（内径为6.5mm，孔径为8.0μm）及MatrigelTM均购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养基配制 使用HCl或NaOH将DMEM（Cat No.12430-047）调至pH 7.4、7.0及6.6，过滤后加入胎牛血清（10%）备用。

1.2.2细胞体外侵袭实验 将Transwell小室放入24孔细胞培养板，在每个上室的聚碳酸酯膜上涂以50μg Matrigel胶（用无血清DMEM稀释）；下室加入含10%FBS的DMEM培养基800μl。取对数生长期细胞，用胰酶消化，离心（1 000 r/m，5 min）后重悬于无血清DMEM培养液，上室内加入2×105个细胞/室，继续使用pH 7.4、7.0及6.6培养基培养48 h后，吸弃小室内培养基，取出小室。用棉签拭去膜基质和上室内表面细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在光学显微镜下拍照并计数［6］。每组设3个平行样本，每个样本观测5个视野（10×）并进行全孔计数。实验重复3次。

1.2.3细胞体外迁移实验 细胞体外迁移实验与侵袭实验方法相同，但Transwell小室底部膜的内表面上未铺Matrigel。取对数生长期细胞，用胰酶消化，离心（1 000 r/m，5 min）后重悬于无血清DMEM培养液，上室内加入2×105个细胞/室，使用pH 7.4、7.0及6.6培养基培养48 h，吸弃小室内培养基，取出小室。用棉签拭去膜基质和上室内表面细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，洗去染色液，空气干燥，在光学显微镜下拍照。然后加入10%的冰醋酸，静置30 min，待结晶紫溶解后，各实验组分别取100μl于96孔板中，使用光栅型连续波长酶标仪（infinite M200 PRO仪器），读取各孔在560 nm波长处吸光值并记录。每组设3个平行样本，实验重复3次。

1.2.4细胞骨架肌动蛋白Actin染色 PC-3细胞分别使用pH7.4及pH6.6培养48 h后，用PBS液漂洗盖片培养的细胞3次，之后用4%的甲醛/PBS液固定细胞10 min，PBS漂洗3次；用Alexa FluorR 594 phalloidin在（1∶10）室温中反应15 min后，PBS漂洗3次，使用60%甘油+荧光防淬剂封片。使用激光共聚焦显微镜进行观察，激发波长581 nm，发射波长609 nm。

1.2.5Rac1活化蛋白检测 PC-3细胞分别使用pH7.4及pH6.6培养48、72 h后，按试剂盒说明书进行操作，提取细胞蛋白，进行Western blot实验。将提取的蛋白，经丙烯酰胺凝胶（12%分离胶+6%浓缩胶）电泳后转移至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，Rac1一抗（1∶500稀释，鼠源性）、β-actin一抗（1∶500稀释，鼠源性）4℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1∶1 000稀释）孵育2 h，TBST洗涤，与免疫印迹化学发光试剂（ECL）反应，X线片曝光，显影，定影。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，取95%可信区间，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸性微环境促进前列腺癌细胞PC-3的侵袭

在侵袭实验中，pH 7.4、7.0及6.6组均设3个平行样本，实验重复3次，在不同pH培养基培养48 h后终止实验。结果统计显示，pH 7.4、7.0及6.6组发生侵袭的细胞个数分别为（134.3±17.55）、（273.7±14.61）、（418.67±14.43），pH6.6组发生侵袭的细胞个数明显高于pH7.4组及pH7.0组差异有统计学意义（F=124.79，P＜0.01）。见图1。

2.2 酸性微环境促进前列腺癌细胞PC-3的迁移

在迁移实验中，pH 7.4、7.0及6.6组均设3个平行样本，实验重复3次。在不同pH培养基培养48 h后终止实验并进行结晶紫染色，然后加入10%的冰醋酸2 ml；待结晶紫溶解后，取100μl于96孔板中，使用酶标仪（infinite M200 PRO仪器）记录各孔在560 nm波长处吸光值。pH 7.4、7.0及6.6组所测OD值分别为（0.045 1±0.005 8）、（0.066 1± 0.007 9）、（0.136 0±0.008 9），差异有统计学意义（F=53.501，P＜0.01）。见图2。

2.3 酸性微环境促进前列腺癌细胞PC-3细胞骨架肌动蛋白的聚合将前列腺癌细胞PC-3进行细胞爬片，在不同pH培养基培养48 h后终止实验，4%多聚甲醛（D-PBS溶液配制）固定细胞15 min，使用Alexa FluorR 594 phalloidin对细胞骨架肌动蛋白进行染色，通过激光共聚焦显微镜进行观测。观测结果显示，与pH7.4组细胞相比，pH6.6组的PC-3细胞内的F-actin呈现明亮的红色，呈细束状竹排样结构，沿细胞极性平行排列。与pH7.4组细胞相比，pH6.6组PC-3细胞内的F-actin聚合更明显。见图3。

2.4 酸性微环境促进前列腺癌细胞PC-3Rac1蛋白的活化在不同pH培养基培养前列腺癌PC-3细胞，于48 h后提取细胞蛋白，进行Rac1活化蛋白及Rac1 Western blot检测。实验结果显示，pH6.6组细胞Rac1活化形式GTP-Rac1明显高于pH7.4组细胞（图4A）。Rac1活化形式GTP-Rac1光密度值与Rac1光密度值比值为：pH7.4组：0.134 3± 0.008 7（经GAPDH校正）（n=3），pH7.0组：0.777 7±0.040 4（经GAPDH校正）（n=3），pH6.6组：1.173 3±0.028 5（经GAPDH校正）（n=3）（F= 506.60，P＜0.01）（图4B）。

3 讨论

肿瘤的转移分多个步骤进行，包括肿瘤细胞在原位癌的脱离与迁移、侵袭并降解细胞外基质、侵入血液血管和循环系统、在一个遥远的部位再生长等诸多步骤。这一过程不仅与肿瘤的遗传背景密切相关，更受到肿瘤所在微环境的强烈影响。肿瘤血管结构和功能的改变是肿瘤微环境的生成关键因素，肿瘤血管结构和网络功能的畸变导致肿瘤局部氧气和营养的供应不足，从而导致肿瘤代谢的变化，肿瘤细胞代谢重组，其能量代谢向糖酵解转变［7］。肿瘤细胞糖酵解的发生，以及肿瘤血管结构和网络功能畸变所导致的低灌注，使肿瘤细胞外周乳酸升高，从而使肿瘤外周呈明显的酸化［8］。酸性肿瘤微环境不仅促进血管生成［9］，抑制抗肿瘤免疫反应［10］，更影响肿瘤侵袭和转移［11］。本研究的侵袭及迁移实验中，使用不同pH培养基培养前列腺癌细胞PC-3，发现酸性微环境可以明显促进前列腺癌细胞PC-3的侵袭与迁移。

研究［12］表明，pH值可以刺激细胞的运动迁移，并导致细胞骨架的重组。本研究使用不同pH培养基培养前列腺癌细胞PC-3，采用Alexa FluorR 594 phalloidin对细胞骨架肌动蛋白（Actin）进行染色，通过激光共聚焦显微镜进行观测。观测结果显示，与pH7.4组细胞相比，pH6.6组的PC-3细胞内的F-actin呈现明亮的红色，呈细束状竹排样结构，沿细胞极性平行排列。证实酸性微环境可以促进前列腺癌细胞PC-3细胞骨架肌动蛋白（Actin）的聚合。

细胞运动过程不但涉及细胞不同部位的肌动蛋白骨架的连续重构，还包括迁移细胞与细胞外基质间的黏附和解黏附过程，该过程包括如下几个步骤：细胞在运动方向上形成片状伪足及丝状伪足、在伪足面上细胞表面蛋白酶（例如基质金属蛋白酶）选择性降解细胞外基质、细胞迁移前缘与细胞外基质形成新的黏附点而后缘的黏附结构解离［13］，细胞运动过程主要由Rho蛋白家族的一组Ras相关蛋白进行调控［14］。

目前为止，在人类细胞中已经发现了20多个Rho蛋白家族成员，分为3个亚家族—Rho蛋白、Rac蛋白和Cdc42蛋白。该蛋白家族成员结合GTP时处于活化状态，当GTP水解成GDP时处于失活状态［15］。Rho蛋白家族在调节肌动蛋白（细胞骨架）的活动、细胞分裂增殖、细胞变形中起关键作用，从而调控细胞迁移、参与肿瘤的转移。其中亚家族Rac1全称为Ras相关的C3肉毒素底物1，有调节细胞骨架重组，片状伪足形成，细胞形体极化，促进细胞运动与迁移，促进血管生成的作用。Rac1对细胞侵袭和迁移的可能机制为：①促进整合素家族蛋白在细胞头部募集，并将细胞级联信号传递到细胞肌动蛋白骨架，诱导肌动蛋白微丝聚集，产生片状伪足；②活化下游重要调节因子凝溶胶蛋白，改变肌动蛋白细胞骨架，影响细胞的运动及侵袭力；③通过与下游的血小板源性生长因子的信号途径、百日咳毒素敏感性G蛋白及cAMP依赖性途径相互作用影响细胞的运动［16］。本研究使用不同pH培养基培养前列腺癌细胞PC-3，提取细胞蛋白，进行Western blot检测，发现酸性微环境明显促进前列腺癌细胞PC-3 Rac1蛋白的活化。

［1］ Jemal A，Bray F，CenterM M，etal.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［2］ 毕新刚，韩仁强，周金意，等.2009年中国前列腺癌发病和死亡分析［J］.中国肿瘤，2013，22（6）：417-22.

［3］ Pollard JW.Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2004，4（1）：71-8.

［4］ Liotta L A，Kohn E C.Themicroenvironment of the tumour-host interface［J］.Nature，2001，411（6835）：375-9.

［5］ Cardone R A，Casavola V，Reshkin SJ.The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+exchanger in metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（10）：786-95.

［6］ 谭 宁，覃文新，刘青波，等.肿瘤外周酸性微环境促进肝癌HCCLM3细胞的转移［J］.肿瘤，2009，10（29）：919-22.

［7］ Cairns R A，Harris IS，Mak TW.Regulation of cancer cellmetabolism［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（2）：85-95.

［8］ Bhujwalla ZM，Artemov D，Ballesteros P，et al.Combined vascular and extracellular pH imaging of solid tumors［J］.NMR Biomed，2002，15（2）：114-9.

［9］ Bischoff D S，Zhu JH，Makhijani N S，et al.Acidic pH stimulates the production of the angiogenic CXC chemokine，CXCL8（interleukin-8），in human adultmesenchymal stem cells via the extracellular signal-regulated kinase，p38mitogen-activated protein kinase，and NF-kappaB pathways［J］.J Cell Biochem，2008，104（4）：1378-92.

［10］Dietl K，Renner K，Dettmer K，et al.Lactic acid and acidification inhibit TNF secretion and glycolysis of human monocytes［J］. J Immunol，2010，184（3）：1200-9.

［11］Hashim A I，Zhang X，Wojtkowiak JW，et al.Imaging pH and metastasis［J］.NMR Biomed，2011，24（6）：582-91.

［12］Martin C，Pedersen SF，Schwab A，et al.Intracellular pH gradients in migrating cells［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2011，300（3）：C490-5.

［13］Ananthakrishnan R，Ehrlicher A.The forces behind cell movement［J］.Int JBiol Sci，2007，3（5）：303-17.

［14］Sahai E，Marshall C J.RHO-GTPases and cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（2）：133-42.

［15］Heasman SJ，Ridley A J.Mammalian Rho GTPases：new insights into their functions from in vivo studies［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（9）：690-701.

［16］Etienne-Manneville S，Hall A.Rho GTPases in cell biology［J］. Nature，2002，420（5）：629-35.

Acidic extracellular m icroenvironment promotes PC-3 cell m igration and enhances the activity of Rac1

Gao Li1，Tan Ning2，Zhang Tianyu1，et al
（1Dept of Urology，The Affiliated Hospital，Guilin Medical College，Guilin 541004；2The Center of Science Research，Guilin Medical College，Guilin 541004）

ObjectiveTo investigate whether tumor acidic-microenvironment can promote the migration of human prostatic carcinoma cell PC-3.MethodsPC-3 cellswere cultured inmediawith different pH values（pH 7.4，pH 7.0，pH 6.6）.Invasion and migration assay were utilized to analyze themetastasis of PC-3 cells in vitro.F-actin fluorescence staining was performed and observed by 1aser confocal scanning microscope.The activation of Rac1 was examined by western blot.ResultsAcidic microenvironment could enhance the capacity of PC-3 cellmigration and invasion remarkably（P＜0.01）.Meantime，the intensity of F-actin significantly was increased and the activity of Rac1was up-regulated.ConclusionThe results suggest that acidic microenvironmentmay be involved in cancermetastasis and play an important role in promotion of cancermetastasis.

acidic extracellularmicroenvironment；human prostatic cancer；migration；actin；Rac1

R 737.25

A

1000-1492（2016）03-0333-05

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.010.html

2015-12-08接收

广西自然科学基金项目（编号：2010GXNSFA183013）；桂林市科学研究与术开发计划项目（编号：20130120-15）

1桂林医学院附属医院泌尿外科、2桂林医学院科学实验中心，桂林 541004

3上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室，上海 200032

高 漓，男，副主任医师；

谭 宁，男，副研究员，硕士生导师，责任作者，E-mail：wind146wind@aliyun.com