B细胞受体核心岩藻糖基化调节成熟B细胞的信号转导

于 蕊，刘红霞，孙世杰，王惠国，李文哲

B细胞受体核心岩藻糖基化调节成熟B细胞的信号转导

于 蕊1，刘红霞2，孙世杰2，王惠国1，李文哲2

目的探讨核心岩藻糖基转移酶（Fut8）对成熟B细胞信号转导的影响。方法利用Fut8-siRNA逆转录病毒载体建立Fut8基因沉默成熟B细胞株（3-83-KD细胞），并将PLHCX-Fut8质粒导入3-83-KD细胞建立Fut8基因恢复成熟B细胞株（3-83-KD-Re）。用Real time-PCR、Western blot和HPLC法检测Fut8 mRNA、蛋白表达和Fut8酶活性，流式细胞仪和凝集素免疫印迹检测BCR的表达量和核心岩藻糖基化水平，Western blot技术检测细胞内酪氨酸磷酸化水平。结果与3-83细胞相比，3-83-KD细胞的BCR核心岩藻糖基化水平明显下降，而3-83-KD-Re细胞其表达得到恢复。Fut8基因沉默使3-83-KD细胞BCR介导的信号传导明显减弱，而3-83-KD-Re细胞的信号传导恢复正常。结论Fut8修饰的核心岩藻糖基化在BCR介导的细胞信号转导过程中发挥重要的调节作用。

核心岩藻糖基转移酶；siRNA；B细胞受体；信号转导

成熟B细胞的抗原识别及B细胞受体（B cell receptor，BCR）介导的细胞信号转导是体液免疫应答调节的重要组成部分［1］。质谱分析表明IgG-BCR分子是富含有核心岩藻糖基的糖蛋白［2］，核心岩藻糖基修饰对IgG-BCR的生物活性具有重要的调节作用。但目前核心岩藻糖基化对IgG-BCR介导的信号传导尚不清楚。核心岩藻糖基转移酶（α-1，6-fucosyltransferase，Fut8）是催化核心岩藻糖修饰的唯一的糖基转移酶，是以GDP-岩藻糖为活化的糖基供体，以α-1，6糖苷键的形式把岩藻糖移交到N-糖链还原末端的乙酰葡糖胺，形成核心岩藻糖基［3］。研究［4-6］显示Fut8在B细胞的分化发育中发挥重要的调节作用。该实验以成熟B细胞株即3-83细胞，该细胞为BCR转基因模型，在p31刺激下，表达IgG2a-BCR［7］）为研究对象，通过RT-PCR、实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，研究Fut8对成熟B细胞活化过程的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料逆转录病毒载体PSINsi-hU6、PLHCXFut8-mutant cDNA质粒为本实验室保存；3-83细胞株购自美国ATCC公司；逆转录酶、dNTP mixture、RNase抑制剂、DNA连接试剂盒、Ex Taq酶、质粒提取试剂盒购于大连TaKaRa公司实验室常规试剂购于上海生工公司；G418购自美国AMRESCO公司；Anti-mouse IgG2a等一抗购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自江苏碧云天公司；生物素标记-AOL购自日本TCI；抗GAPDH（FL-355）抗体购自美国Santa Cruz（sc-25778）；生物素标记p31由北京中科亚光公司合成；膜蛋白提取试剂盒（BSP049）购自上海生工生物公司。

1.2 细胞模型的制备筛选出最佳的Fut8 siRNA序列，siRNA-sense：5′-GATCCTCTCAGAATTGGCGCTATGT-TCAAGAGACATAGCGCCAATTCTGAGACTTTTTTAT-3′；siRNA-antisense：5′-CGATAAAAAAGGTATCGCGGTTAA-GACTCTTCTCTTGAAAGAGTCTTAACCGCGATACCG-3′，该序列位于小鼠Fut8基因（NM_016893）的1386～1404位。Fut8基因沉默细胞（3-83-KD）模建立：准备阶段：5×105个3-83细胞置于6孔板内，37℃培养。感染阶段：利用聚凝胺处理细胞后，加入含Fut8-siRNA的逆转录病毒液，37℃，CO2培养箱中孵育6 h，再追加1ml培养液到6孔板中过夜培养。G418筛选阶段：加入G418（400μg/ml）的培养液，每2 d更换一次G418的培养液，两周后挑选单个克隆置于96孔板中培养扩大培养，获得稳定遗传的沉默细胞模型命名为3-83-KD。Fut8恢复细胞（3-83-KD-Re）模型建立：准备阶段：5×1053-83-KD细胞置于6孔板内，37℃培养。转染阶段：将梭华-Sofast和Fut8-pLHCX质粒按一定比例混合，并转染至3-83-KD细胞，37℃孵育6 h，然后再加入1ml含20%血清的DEME培养液，37℃，CO2培养箱中孵育24～48 h。筛选阶段：加入潮霉素（200μg/ml）于培养液中，每隔3 d换一次含潮霉素的培养液，2周后挑取单个克隆细胞进行扩大培养，获得稳定遗传的具有潮霉素抗性的Fut8基因恢复细胞株，命名为3-83-KD-Re。

1.3 实时定量PCR按TRIzol RNA提取试剂盒的操作说明提取细胞总RNA。以Oligo（dT）为起始引物，按照反转录说明书操作进行反转录合成cDNA。PCR程序：变性：94℃3 min，退火：93℃10 s，60℃20 s，72℃1 min 35个循环，延伸：72℃10 min。引物序列为：5-AACAGCTTGTTAAGGCCAA AG-3 and 5-GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC-3（Fut8）（NM_016893）；5-GCAAGAGCTACAGCATGAGAG-3 and 5-TGCCGCCAGCGAAGAGACGCT-3（Fut4）（NM_ 010242）；5-TCAAGCCATCAACATCAAC-3 and 5-GTGGCGGATGTACTCGAAGG-3（GnT III）（NM_010795）；5-CAGCGCCAGCAACTCGACTA-3 and 5-TCGATTGAA CATGGTGTCTCCAG-3（β4GalT-Ⅰ）（NM_022305）；5-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3 and 5-TGAAGGGGT CGTTGATGG-3（GAPDH）（NM_001001303）。

1.4 高效液相色谱（HPLC）检测酶活性底物为PABA［4-（2-pyridylamino）butylamine］标记的GnGnbi-Asn-PABA（S）。通过HPLC对其产物（GnGnFucbi-Asn-PABA）（P）进行分析，Fut8酶活性［pmol/（h ·mg）］按照公式［P（pmol）/反应时间（h）蛋白含量（mg）］来计算。

1.5 流式细胞术分析细胞表面BCR的表达首先利用BSA-抗-CD16/CD32（2.4G2）抗体混合液对细胞表面的Fc受体进行封闭，然后加入荧光标记抗体在冰上反应15 min。利用流式细胞仪（FACSCalibur）进行分析。

1.6 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）纯化膜蛋白根据膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白，测定蛋白浓度后取蛋白（约500μg）与抗-IgG2a以及G-Sepharose充分混匀4℃摇晃过夜，之后用PBS洗两次，加无变性剂loading buffer 100℃煮5 min待用。

1.7 Westernblot和lectinblot法分析细胞内蛋白的表达按标准方法进行SDS-PAGE，将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%BSA封闭2 h后，加入合适的一抗或生物素标记-AOL（米曲霉素，特异性识别核心岩藻糖基），摇床过夜，洗膜后加入二抗，孵育1 h，洗膜后ECL显色并扫描。

2 结果

2.1 3-83-KD细胞及3-83-KD-Re细胞特性利用含Fut8-siRNA的重组逆转录病毒及Fut8-pLHCX质粒，建立3-83-KD细胞及3-83-KD-Re细胞。RTPCR结果显示，与正常3-83细胞相比，3-83-KD细胞中Fut8 mRNA的表达量明显减少（图1A），而在3-83-KD-Re细胞中其表达得到恢复。实时定量PCR结果也显示，38-3-KD细胞的Fut8 mRNA表达量小于3-83细胞的5%（图1B），但Fut4，GnTⅢ和β4GalT-I等其它糖基转移酶的表达量并没有明显的变化（图1B）。Western blot实验结果进一步显示，与正常3-83细胞相比，Fut8蛋白含量明显减少（图1C），而在3-83-KD-Re细胞中得到恢复。此外，通过HPLC技术检测了Fut8的酶活性，结果显示3-83细胞和3-83-KD-Re细胞在20 min处出现特异性Fut8酶产物，而3-83-KD细胞在20 min处并没有出现特异性Fut8酶产物（图1D）。

2.2 细胞表面的IgG-BCR是核心岩藻糖基化糖蛋白BCR介导的信号是B细胞活化、增殖和分化的关键。流式细胞术检测结果显示，3-83、3-83-KD、3-83-KD-Re细胞之间IgG2a-BCR的表达量没有明显的差别（图2A）。但是Lectin blot结果表明3-83-KD细胞中IgG2a-BCR的核心岩藻糖基化修饰缺失，在3-83-KD-Re细胞中又得到恢复（图2B）。

2.3 核心岩藻糖基化修饰影响BCR介导的下游信号分子磷酸化BCR复合物是由识别抗原的膜表面免疫球蛋白（the membrane surface immunoglobulin，m Ig）与传递抗原刺激信号的CD79a/CD79b（cluster of differentiation，CD）异源二聚体所组成。BCR与特异性抗原表位结合后，由CD79a和CD79b把此激活信号转入细胞内，并通过Fyn、Lyn、Syk、Vav、PLCγ2及钙离子流出，激活B细胞［8］。3-83细胞表面的BCR特异性识别p31抗原肽（HDWRSGFGGFQHLCC）。为了更进一步确认核心岩藻糖基修饰对BCR介导的细胞信号传导的影响，用p31作用不同种类的3-83细胞，检测细胞内信号分子的酪氨酸磷酸化情况。用p31（0.1μg/ml）处理后，与正常的3-83细胞相比，3-83-KD细胞在5 min和15 min时酪氨酸磷酸化水平明显的下降，但在3-83-KD-Re细胞中磷酸化水平又得到恢复（图3a）。进一步的研究结果显示，3-83-KD细胞中BCR下游信号分子，如CD79a和Syk分子的磷酸化水平明显下降，而在3-83-KD-Re细胞中又得到恢复（图3b）。

3 讨论

BCR介导的信号是B细胞活化的第一信号，是B细胞成熟和活化的关键步骤。最新研究［9］表明，糖基化对BCR功能具有重要的影响，如糖基化在维系BCR水溶性和立体构象中起重要作用，糖基化程度低下，会使BCR肽链缺乏刚性；糖基化过度，会遮住BCR的Ag结合位点，影响与Ag的结合。

Fut8是修饰核心岩藻糖基化的唯一的糖基转移酶。基因敲除小鼠实验［5-6］表明Fut8在B细胞的分化发育中发挥重要的调节作用。阐明某个基因的功能，目前常用的方法是利用siRNA，抑制该基因表达，观察其相应功能的丢失；然后细胞内重新导入该基因，建立转基因恢复模型，观察其丢失功能的恢复。与正常3-83细胞相比，3-83-KD细胞中Fut8 mRNA明显减少，而Fut4、GnT-Ⅲ及β4-GalT-ⅠmRNA的表达量没有变化，说明复制缺陷型Fut8-siRNA重组逆转录病毒（pSINsi-hU6）没有脱靶现象。将PLHCX-Fut8质粒导入3-83-KD细胞建立Fut8基因恢复成熟B细胞株（3-83-KD-Re），发现在3-83-KD-Re细胞中Fut8 mRNA、蛋白表达和Fut8酶活性表达得到恢复。IgG-BCR是富含核心岩藻糖基化糖蛋白，也是Fut8的重要的靶蛋白。Fut8基因沉默并没有影响IgG2a-BCR的表达量，只是影响了IgG2a-BCR核心岩藻糖基化水平。进一步研究表明，核心岩藻糖修饰能够调节IgG-BCR与抗原肽（p31）之间的相互作用。Fut8基因沉默使IgG-BCR介导的信号传导（p31刺激细胞）明显减弱，而3-83-KD-Re细胞的信号传导得到恢复。本实验结果提示核心岩藻糖基化修饰在BCR介导的细胞信号转导过程中发挥重要的调节作用，为从糖基化角度揭示B细胞活化规律提供新的科学思路。

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Core fucosylation of B cell receptor regulates the signal transduction ofmature B cells

Yu Rui1，Liu Hongxia2，Sun Shijie2，et al
（1College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622；2College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044）

ObjectiveTo investigate the role of core fucosyltransferase（Fut8）on the signal transduction via B cell receptor in mature B cells.MethodsFirstly，Fut8 gene knockdown mature B cells（3-83-KD cells）were established by using retroviruses containing Fut8-siRNA，and Fut8 gene restored mature B cells（3-83-KD-Re）were generated by transfections of PLHCX-Fut8 plasmid into 3-83-KD cells.The expressions of Fut8mRNA，protein and enzyme activity were detected by real time PCR，Western blot and HPLC，and the expressions of BCR and core fucosylation levelwere detected by flow cytometry and lectin blot，and intracellular tyrosine phosphorylation levelwas detected by Western blot.ResultsThere were no differences on the expression of IgG2a-BCR in 3-83，3-83-KD，3-83-KD-Re cells，while core fucosylation of IgG2a-BCR was abolished in 3-83-KD cells，and rescued by reintroduction of Fut8，as evidenced by AOL blot.Compared to 3-83 cells，the tyrosine phosphorylation was substantially reduced in 3-83-KD cellswith p31 stimulation，and then completely restored by re-introduction of the Fut8 gene to 3-83-KD cells.ConclusionIn summary，core fucosylationmodified by Fut8 plays an important role in the cellular signal transduction via BCR.

Fut8；siRNA；BCR；signal transduction

R 392.11

A

1000-1492（2016）03-0320-04

时间：2016/1/28 14：23：09 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.004.html

2015-12-08接收

国家自然科学基金项目（编号：31270864、30972675）

1大连大学生命科学与技术学院生物学专业，大连116622

2大连医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，大连 116044

于 蕊，女，硕士研究生；

李文哲，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：liwenzhe46@hotmail.com

王惠国，女，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wanghuiguo126@126.com