核糖体蛋白L6在前列腺癌中的表达及临床意义

张蒙，盛镔，马鹏德，张昌文，徐勇



核糖体蛋白L6在前列腺癌中的表达及临床意义

张蒙，盛镔，马鹏德，张昌文，徐勇△

摘要:目的探讨核糖体蛋白L6（RPL6）在前列腺癌组织中的表达及临床意义。方法应用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）和Western blot检测RPL6在前列腺癌组织（80例）及癌旁组织（62例）中的表达水平，分析RPL6mRNA表达水平与前列腺癌患者的临床病理特征及预后之间的关系。结果RPL6在前列腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P < 0.05)；血清前列腺特异性抗原（PSA）值高、Gleason评分高、临床分期晚、有淋巴结转移患者的RPL6mRNA表达水平增高（均P < 0.05），而不同年龄、精囊侵袭、血管侵犯及手术切缘阳性情况患者的RPL6mRNA表达水平无明显差异(均P > 0.05)。RPL6mRNA高表达前列腺癌患者的术后无生化复发生存率较低（χ2=4.530,P= 0.033）。结论RPL6表达水平增高与前列腺癌的发生发展及不良预后相关；或可用其作为初步判断前列腺癌患者预后的肿瘤标志物。

关键词：核糖体蛋白L6；前列腺癌；实时荧光定量PCR；预后

前列腺癌是男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，在发达国家其位居男性新发肿瘤的第一位[1]。近年来，随着生活方式的西方化、人口老龄化以及诊疗技术的革新，前列腺癌在我国的发病率逐年上升，已严重威胁着我国男性的健康[2]。因此，研究前列腺癌发生发展的分子机制，对于前列腺癌的诊治具有重要意义。核糖体蛋白L6（ribosomal protein L6, RPL6）是核糖体大亚基的组成蛋白，在白血病、胃癌中存在异常表达，且在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色[3-4]。在前列腺癌中RPL6的表达情况及其临床意义尚少见报道。本研究旨在探讨RPL6在前列腺癌中的表达及其临床意义，为前列腺癌的诊疗提供参考。

1　资料与方法

1.1一般资料收集我院泌尿外科2007年1月—2013年5月手术切除的前列腺癌标本80例及癌旁标本62例，术后立即采集标本，液氮速冻后放于-80℃保存。所有标本均经病理学证实，患者术前均未行放、化疗及雄激素剥夺治疗。收集患者以下几项资料：年龄、术前血清前列腺特异性抗原（PSA）值、Gleason评分、淋巴结转移、血管侵犯、精囊侵犯、病理分期及手术切缘阳性情况。生化复发的定义为：前列腺癌根治术后连续2次监测血清PSA的值均大于0.2 μg/L。

1.2主要试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自Thermo公司，荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒购自Roche公司，兔抗人RPL6多克隆抗体购自美国Pro⁃teintech公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝公司。引物由苏州金唯智公司合成。

1.3RT-qPCR检测RPL6mRNA表达Trizol法提取组织标本的总RNA，反转录之前检测RNA的浓度和纯度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，以GAPDH作为内参，在Eco Real-Time PCR System上检测RPL6mRNA的表达。RPL6引物序列：上游5′-ATGGCGGGTGAAAAAGTTG-3′，下游5′-TCCTCACAAATTGGTGTTCTAAAT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游5′-GGAAGATGGTGATGGGATT- 3′。扩增体系10 μL，SYBR Greenmaster 5 μL，上、下游引物混合物0.2 μL，cDNA模板1 μL，无酶水3.8 μL。反应条件为：94℃3min，然后94℃30 s，58℃30 s，72℃1min，共40个循环，最后72℃延伸5min。RT-qPCR扩增结果通过相对定量法（2-△△Ct）进行分析，每次实验重复3次。

1.4Western blot检测RPL6蛋白表达取100mg组织标本，加入哺乳动物蛋白抽提裂解液并超声破碎，4℃12 000×g离心10min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，加入兔抗人RPL6多克隆抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000）室温孵育1h后，滴加ECL显影液，以GAPDH作为内参，凝胶成像仪显像并记录结果。

1.5统计学方法数据用SPSS 19.0进行统计处理，两样本均数的比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；生存分析用Kalpan-Meier曲线估计，行Log-rank检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组RPL6mRNA及蛋白表达结果前列腺癌组织中RPL6mRNA及蛋白的表达水平均明显高于癌旁组织，见图1、2。

2.2前列腺癌中RPL6mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系以RPL6mRNA在前列腺癌中表达水平的均数（1.74）为分界点，高于平均数的为高表达组（49例），低于平均数的为低表达组（31例），分析RPL6mRNA的表达水平与前列腺癌患者临床病理特征的关系。结果表明，血清PSA值高、Gleason评分高、临床分期晚、有淋巴结转移患者的RPL6mRNA表达水平增高（均P < 0.05），而不同年龄、血管侵犯、精囊侵袭及手术切缘阳性患者的RPL6mRNA表达水平无明显差异(均P > 0.05)，见表1。

Fig.1　The relative expression level of RPL6mRNA in prostate cancer tissues and noncancerous tissues图1　前列腺癌组织和癌旁组织中的RPL6mRNA表达水平

Fig.2　The relative expression level of RPL6 protein in prostate cancer tissues (T) and noncancerous tissues (N)图2　前列腺癌组织和癌旁组织中的RPL6蛋白表达水平

Tab.1　The relationship between RPL6 expression and clinicopathological features of prostate cancer表1　RPL6mRNA表达水平与前列腺癌临床病理参数之间的关系

2.3RPL6mRNA表达与患者预后的关系生存曲线结果表明：RPL6mRNA高表达前列腺癌患者的术后无生化复发生存率较低（χ2=4.530，P=0.033），见图3。

Fig.3　The relationship between RPL6mRNA expression with biochemical recurrence-free survival time in patients with prostate cancer图3　前列腺癌患者中RPL6mRNA表达与无生化复发生存时间的关系

3　讨论

核糖体蛋白是核糖体的主要组成成分，其在蛋白质合成中发挥重要的作用。近年来，越来越多的研究表明核糖体蛋白除了参与组成核糖体之外，也参与细胞的生长、增殖及凋亡等众多生理活动的调控[5]。近年来的研究表明，核糖体蛋白在多种肿瘤中存在异常表达[6-11]，核糖体蛋白在肿瘤发生发展中所发挥的重要作用受到越来越多的关注。

在肿瘤进展的过程中，癌基因Myc和抑癌基因PTEN、pRb及p53可以直接参与调控核糖体的产生及蛋白质的翻译[12-14]，这揭示了一些癌基因或者抑癌基因可以通过调控核糖体蛋白或核糖体的产生来调控肿瘤的进展，如促进肿瘤细胞的生长、增殖及转移。在胃癌中，RPL6可通过上调细胞周期素E促进细胞周期的进展，进而促进肿瘤细胞增殖[15]。但是在前列腺癌中，RPL6是否通过上述机制参与肿瘤的发生发展需要进一步的探索。总之，研究核糖体蛋白在参与组成核糖体之外的生物学功能，有利于阐明肿瘤发生发展的机制，还为探索癌症潜在诊疗靶点提供了新的可能。

本研究通过RT-qPCR及Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平上检测了RPL6在前列腺癌组织中以及癌旁组织中的表达情况，结果表明，RPL6在前列腺癌组织中的表达明显增高，提示其在前列腺癌的发生发展中扮演一定的角色，具有潜在的辅助诊断及作为治疗靶点的价值。这一研究结果与RPL6在胃癌[4]中表达上调结果相似。此外，笔者分析了RPL6mRNA的表达量与前列腺癌临床病理特征的关系，结果显示RPL6mRNA表达水平增高与前列腺癌患者较高的血清PSA值、高Gleason评分、淋巴结转移、临床分期及血管侵犯有关，与患者的年龄、精囊侵犯及手术切缘阳性无关。随后笔者对RPL6mRNA的表达情况与患者的无生化复发生存率进行分析，发现高表达RPL6mRNA的患者的生存时间明显较低表达患者低，说明RPL6基因的高表达降低了前列腺癌患者术后的生存时间。由于样本数量有限，今后需要进一步扩大样本量以便更好地了解RPL6的异常表达在前列腺癌中的意义。

综上，本研究结果提示RPL6在前列腺癌中高表达，与前列腺癌的一些临床病理参数具有一定的相关性，且在前列腺癌患者的预后预测中具有潜在的指导价值，但是有关RPL6在前列腺癌发生发展中的作用机制目前还不明确，仍需要进一步的深入研究。

参考文献

[1] Siegel RL,miller KD, Jemal A.Cancer statistics, 2015[J].CA Can⁃cer J Clin, 2015, 65(1):5-29.doi: 10.3322/caac.21254.

[2]han SJ, Zhang SW, Chen WQ, et al.Analysis of the status and trends of prostate cancer incidence in China [J].Chinese Clinical Oncology, 2013, 18(4):330-334.[韩苏军，张思维，陈万青，等.中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析[J].临床肿瘤学杂志, 2013, 18(4):330-334] .doi:10.3969/j.issn.1009-0460.2013.04.009.

[3] Chenh, Xie ZX, Jiangh, et al.Effect of ribosomal protein L6 on drug resistance and apoptosis in K562/A02 cells[J].Journal of Ex⁃perimentalhematology, 2007, 15(2):292-295.

[4] Wu Q, Gou Y, Wang Q, et al.Downregulation of RPL6 by siRNA in⁃hibits proliferation and cell cycle progression ofhuman gastric can⁃cer cell lines [J].PLoS One, 2011, 6(10):e26401.doi: 10.1371/jour⁃nal.pone.0026401.

[5] De LashA, Perucho L, Paciucci R, et al.Ribosomal proteins as nov⁃el players in tumorigenesis[J].Cancermetastasis Rev, 2014, 33(1): 115-141.doi: 10.1007/s10555-013-9460-6.

[6] An SJ, Chen JK, Liu LL, et al.Over-expressed genes detected by suppression subtractivehybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE [J].Biomed Environ Sci, 2005, 18(5):302-306.

[7] Ohl F, Jungm, Xu C, et al.Gene expression studies in prostate can⁃cer tissue: which reference gene should be selected for normaliza⁃tion [J].Jmolmed (Berl), 2005, 83(12):1014-1024.

[8] Wangm,hu Y, StearnsmE.RPS2: a novel therapeutic target in prostate cancer [J].J Exp Clin Cancer Res, 2009, 28:6.doi: 10.1186/1756-9966-28-6.

[9]huang CJ, Chien CC, Yang SH, et al.Faecal ribosomal protein L19 is a genetic prognostic factor for survival in colorectal cancer[J].J Cellmolmed, 2008, 12(5B):1936- 1943.doi: 10.1111/j.1582-4934.2008.00253.x.

[10] Pomeroy SL, Tamayo P, Gaasenbeekm, et al.Prediction of central nervous system embryonal tumour outcome based on gene expres⁃sion[J].Nature, 2002, 415(6870):436-442.

[11]huang XP, Zhao CX, Li QJ, et al.Alteration of RPL14 in squamous cell carcinomas and preneoplastic lesions of the esophagus[J].Gene, 2006, 366(1):161-168.

[12] ClemensmJ.Targets andmechanisms for the regulation of transla⁃tion inmalignant transformation [J].Oncogene, 2004，23(18):3180-3188.

[13] Pestov DG, Strezoska Z, Lau LF, et al.Evidence of p53-dependent cross-talk between ribosome biogenesis and the cellcycle: effects of nucleolar protein Bop1 on G(1)/S transition[J].Mol Cell Biol，2001， 21(13):4246-4255.

[14] Boon K, CaronhN, Van Asperen R, et al.N-myc enhances the ex⁃pression of a large set of genes functioning in ribosome biogenesis and protein synthesis[J].EMBO J, 2001, 20(6):1383-1393.

[15] Gou Y, Shi Y, Zhang Y, et al.Ribosomal protein L6 promotes growth and cell cycle progression through upregulating cyclin E in gas⁃tric cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，393(4): 788-793.doi: 10.1016/j.bbrc.2010.02.083.

（2015-07-01收稿2015-08-05修回）

（本文编辑闫娟）

Expression and clinical significance of ribosomal protein L6 in prostate cancer

ZHANGmeng, SHENG Bin,mA Pengde, ZHANG Changwen, XU Yong△
The Second Affiliatedhospital of Tianjinmedical University, Tianjin Institute of Urology, Tianjin 300211, China
△Corresponding Author E-mail:xuyongprof@163.com

Abstract:Objective To explore the expression of ribosomal protein L6 (RPL6) in prostate cancer and its clinical sig⁃nificance.Methods RT-qPCR and Western blot assay were used tomeasure themRNA transcription and protein expres⁃sion levels of RPL6 in prostate cancer tissues (n=80) and adjacent non-cancerous tissues (n=62).The relationship between RPL6mRNA expression level and clinicopathological factors of prostate cancer was statistically analyzed.Results ThemRNA and protein expression levels of RPL6 were significantlyhigher in prostate cancer tissues compared with those of non-cancerous tissues (P < 0.05).There werehigher serum expression levels of prostate specific antigen (PSA) andhigher Gleason score in prostate cancer tissues.The expression level of RPL6mRNA was significantlyhigher in patients with lymph nodemetastasis and late clinical stage (P < 0.05).There were no significant differences in PSA levels between different ages, with or without seminal vesicle invasion and different surgicalmargin status (P > 0.05).Kaplan-Meier survival analysis of biochemical recurrence (BCR)-free survival time showed the significantly lower recurrent rate in patients withhigh RPL6mRNA expression（χ2=4.530,P=0.033).Conclusion The elevated expression of RPL6may play a role in the development of prostate cancer, and which can be used as a tumormarker to assess the prognosis of prostate cancer.

Key words:ribosomal protein L6; prostate cancer; real-time quantitative PCR; prognosis

通讯作者△E-mail:xuyongprof@163.com

作者简介：张蒙（1990），男，硕士在读，主要从事前列腺癌的基础与临床研究

基金项目：天津市应用基础及前沿技术研究计划(12JCYBJC31400)

中图分类号：R737.25

文献标志码：A

DOI:10.11958/59076

作者单位：天津医科大学第二附属医院、天津市泌尿外科研究所（邮编300211）