依达拉奉对大鼠心肌转化生长因子-β1表达及心肌纤维化的影响

王世祥，吴宏超，刘映峰



依达拉奉对大鼠心肌转化生长因子-β1表达及心肌纤维化的影响

王世祥，吴宏超，刘映峰△

摘要：目的观察依达拉奉抗大鼠心肌纤维化作用并探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）表达水平与心肌纤维化的关联性。方法40只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和依达拉奉低、中、高剂量组。采用异丙肾上腺素（ISO）建立大鼠心肌纤维化模型。依达拉奉各剂量组予以依达拉奉[分别为3、5、10mg/（kg·d）]干预14 d。第15天检测超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）水平，计算左心室质量指数（LVMI）、胶原容积分数（CVF）；采用免疫荧光和Western blot检测TGF-β1的表达。结果与对照组比较，模型组的MDA、LVMI均显著升高，而SOD显著降低（P < 0.01）。与模型组比较，依达拉奉各剂量组随干预剂量增加，MDA表达递减，SOD表达递增（P < 0.05）；依达拉奉中剂量组SOD与对照组差异无统计学意义，而LVMI呈递减（P < 0.01），依达拉奉高剂量组LVMI与对照组差异无统计学意义。模型组TGF-β1较对照组表达明显上调，依达拉奉各剂量组TGF-β1的表达随剂量的增加而减少，条带灰度减弱。模型组CVF较对照组显著增加；依达拉奉中、高剂量组CVF随剂量的增加而降低，但均高于对照组（P < 0.01）。TGF-β1与MDA、LVMI、CVF呈正相关（r分别为0.931、0.879、0.930，P < 0.001），与SOD呈负相关（r=-0.892，P < 0.001）。结论依达拉奉具有通过减轻氧化应激水平和抑制TGF-β1表达而达到抗心肌纤维化作用。

关键词：氧化应激；纤维化；心肌；转化生长因子β1；依达拉奉

1　材料与方法

1.1药品与试剂依达拉奉（南京先声东元制药有限公司，国药准字H20050280），异丙肾上腺素（湖北康宝泰，CAS No：7683-59-2），超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂（南京建成生物工程研究所），TGF-β1抗体（cell signaling technical，USA），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2仪器酶标仪（Thermo，Multiskanmk3），倒置荧光显微镜（Leica，DMI6000B），电泳仪（上海培清，JS-Power300），电泳槽（Tanon，VE-180），冷冻高速离心机（珠海黑马，TGL-16R），电子分析天平（DENVER INSTRUMENT，TP-214），微型离心机（BMJ，BMJ0826）。

1.3动物实验及分组SPF级雄性SD成年大鼠40只，体质量约300 g，由中山大学实验动物中心提供（合格证号：44008500006902）。按照随机数字表法分成对照组、模型组及依达拉奉低、中、高剂量组，每组8只。动物实验方法符合南方医科大学动物福利和伦理管理委员会要求。

1.4造模及给药方法参考Leenen等[4]的方法，模型组和依达拉奉低、中、高剂量组首次背部皮下注射异丙肾上腺素20.0mg/kg，第2天背部皮下注射10.0mg/kg，第3天注射5.0mg/kg，第4天起3.0mg/kg，连续1周。自由进食、饮水。依达拉奉低、中、高剂量组即在异丙肾上腺素基础上分别给予依达拉奉3、5、10mg/（kg·d），从第2天开始经尾静脉给药，每日2次，连续14 d，造模和给药间隔时间4h以上。对照组给予等量的生理盐水，给予方式、给予时间同实验组。模型组建模1周后，处理同对照组。

1.5酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清SOD、MDA含量末次给药后，全部大鼠禁食24h，于第15天予10%水合氯醛腹腔注射（3mL/kg）麻醉后经尾静脉取血。按试剂盒说明书采用ELISA法检测血清SOD水平和MDA含量。

1.6左心室质量指数（LVMI）测定和心肌组织标本处理全部大鼠经上述取血后，称其体质量（BW）后处死，取出心脏，剔除心房、大血管、心外膜脂肪组织及瓣膜，生理盐水清洗，滤纸吸干，沿房间隔和室间隔剪去左心耳、心房、右室游离壁和血管，电子天平称量包括室间隔在内的左心室质量（LVM），计算LVMI：LVMI=LVM/BW。剪取大鼠心尖部约5mm×5mm×5mm心肌组织，置于液氮中速冻后于-80℃保存，待分子生物学实验用。取剩余部分心脏组织，立即置于4%多聚甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，制成3～4 μm厚石蜡切片，待病理检测用。

1.7心肌组织Masson染色将制成的心肌组织石蜡切片，每组随机取3张，经Masson染色，每张切片随机读取6个不重叠的视野（×400）进行图像采集，用CISA-1000计算机图像分析系统进行分析。胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）为胶原面积/总面积，取平均值作为该切片的CVF进行统计。

1.8免疫荧光法检测TGF-β1蛋白表达从已制成的心肌组织石蜡切片中，每组随机取3张，按照试剂盒说明操作，石腊切片经二甲苯脱蜡2次，每次10min。依次经梯度乙醇脱水。PBS洗5min。3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，室温湿盒孵育10min，PBS洗3×5min。置于柠檬酸抗原修复液，于微波炉中加热至沸腾，低火维持沸腾继续加热8min，待水温自然降至室温，PBS洗3×5min。10%山羊血清室温湿盒封闭30min。一抗4℃孵育过夜。PBS洗3×5min。荧光二抗室温避光孵育30min，PBS洗3×5min。DAPI室温湿盒避光孵育5min。PBS洗1×5min，ddH2O洗2×5min；荧光抗淬灭剂封片。镜检，拍照。

1.9Western blot检测TGF-βl蛋白表达取100mg心肌组织进行匀浆，4℃14 000 r/min离心10min，将上清液转入新的试管内，取10 μL蛋白提取液，用考马斯亮蓝法进行定量。取100 μg蛋白加样于12%聚丙烯酰胺凝胶，转印至PVDF膜，丽春红S染色，与标准蛋白条带对比确定目的片段位置。转膜后将膜置于5%脱脂奶粉中室温封闭2h，加入单克隆抗体TGF-β1（1∶2 000稀释），4℃孵育过夜。第2天膜浸于一抗溶液中，室温平衡1h后，洗膜5次，每次7min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h。TBST溶液洗膜5次，每次7min。采用辣根过氧化物酶HRP-ECL化学发光法检测蛋白条带。以β-actin为内参。用Image J软件计算TGF-β1与β-actin灰度值的比值代表其相对表达量。

1.10统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用t检验；多组均数间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。相关性分析采用Pearson法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1存活情况模型组死亡2只，余均无死亡。

2.2各组MDA、SOD、LVMI的结果比较模型组MDA、LVMI较对照组均显著升高，而SOD显著降低（P < 0.01）。依达拉奉各剂量组随干预剂量增加，MDA含量和LVMI逐渐降低，且均低于模型组，依达拉奉高剂量组MDA含量仍高于对照组，而LVMI与对照组差异无统计学意义。依达拉奉各剂量组随干预剂量增加，SOD水平逐渐增高，且均高于模型组（P < 0.05）；依达拉奉中剂量组与对照组差异无统计学意义，见表1。

Tab.1　Comparison of expression levels ofmDA, SOD and LVMI between five groups表1　各组MDA、SOD、LVMI的比较　（±s）

Tab.1　Comparison of expression levels ofmDA, SOD and LVMI between five groups表1　各组MDA、SOD、LVMI的比较　（±s）

＊＊P < 0.01；a与（1）组比较，b与（2）组比较，c与（3）组比较，d与（4）组比较，P＜0.05；表2同

组别对照组（1）模型组（2）依达拉奉低剂量组（3）中剂量组（4）高剂量组（5）F n8 6　8 8 8mDA（μmol/L）1.048±0.036 1.779±0.034aSOD（U/mL）66.934±3.766 43.025±2.310aLVMI（mg/g）1.803±0.023 2.639±0.042a1.650±0.028ab1.409±0.020abc1.174±0.042abcd88.521＊＊52.236±3.096ab65.886±3.269bc79.026±0.470abcd24.458＊＊2.146±0.031ab1.942±0.036abc1.841±0.018bcd119.421＊＊

2.3Masson染色结果发生纤维化的心肌纤维和血管周围被染成蓝色，未发生纤维化的心肌组织被染成红色。模型组CVF较对照组显著增加；依达拉奉各剂量组CVF随剂量的增加而降低，且均高于对照组，中、高剂量组CVF较模型组显著降低（均P < 0.01），而低剂量组与之差异无统计学意义，见表2。

Tab.2　Comparison of relative expression level of TGF-β1protein andmasson staining of CVF between five groups表2　各组TGF-β1相对表达量、Masson染色CVF的比较　（±s）

Tab.2　Comparison of relative expression level of TGF-β1protein andmasson staining of CVF between five groups表2　各组TGF-β1相对表达量、Masson染色CVF的比较　（±s）

组别对照组（1）模型组（2）依达拉奉低剂量组（3）中剂量组（4）高剂量组（5）F n8 6　8 8 8 TGF-β1/β-actin 0.256±0.006 1.044±0.036aCVF（%）2.523±0.194 17.825±0.910a0.954±0.040a0.591±0.037abc0.495±0.031abcd102.153＊＊16.653±1.143a14.495±1.419ab9.028±0.561abcd44.700＊＊

2.4免疫荧光检测TGF-β1表达的变化模型组心肌组织TGF-β1荧光较强，依达拉奉剂量低、中、高剂量组TGF-β1荧光强度递减，见图1。

2.5Western blot检测心肌TGF-β1蛋白的表达变化模型组TGF-β1较对照组表达明显增强，依达拉奉各剂量组TGF-β1的表达随剂量的增加而减少，条带灰度减弱，其中依达拉奉中、高剂量组较模型组显著降低，而低剂量组与之差异无统计学意义，依达拉奉高剂量组仍高于对照组，见表2、图2。

Fig.1　The immunofluorescence results showing TGF-β1inmyocardial tissues（×400）图1　各组心肌组织TGF-β1免疫荧光图（×400）

Fig.2　The expression of TGF-β1protein detected by Western blot assay图2　Western blot检测各组TGF-β1蛋白表达情况

2.6相关性分析TGF-β1与MDA、LVMI、CVF呈正相关（r分别为0.931、0.879、0.930，P < 0.001），与SOD呈负相关（r= -0.892，P < 0.001）。

3　讨论

3.1氧化应激在心肌纤维化中的作用心肌纤维化的进展最终导致恶性心律失常、心功能不全和心源性死亡[5-6]。因此，有效预防或逆转心肌纤维化的发生，遏制心血管疾病的进展已成为目前心血管疾病研究的重点方向。氧化应激是指由于活性氧簇过量生成和（或）细胞内抗氧化防御系统受损，导致活性氧簇及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态[7-8]。氧化应激被认为是导致心肌纤维化的重要因素。MDA是脂质过氧化产物，反映机体氧化应激水平。SOD是人体一种抗氧化酶，其活力可反映机体清除氧自由基的能力及抗氧化物质的水平。本实验中模型组LVMI值明显升高，提示使用ISO后大鼠心肌间质纤维化明显，经Masson染色可见模型组心肌坏死灶内纤维增生明显，表明心肌纤维化模型制备成功。模型组较对照组MDA明显升高而SOD降低，表明模型组氧化应激明显。由此表明随着氧化应激的增加，心肌纤维化水平升高，这与李贵芝等[9]研究结论一致。

3.2依达拉奉抗氧化应激、抑制TGF-β1及抗心肌纤维化作用依达拉奉具有亲脂性基团，可以有效降低羟自由基浓度、抑制氢氧根离子与铁离子所介导的脂质过氧化，并抑制细胞及组织氧化损伤[9]。在Tajima等[10]的研究中发现，依达拉奉能减轻氧化应激、清除并阻止氧自由基，进而抑制博来霉素诱导的小鼠肺损伤和肺纤维化。依达拉奉可以阻止大鼠自身免疫性心肌炎向扩张型心肌病的发展[11]。TGF-β1的作用在于参与调节细胞外基质（ECM）合成，如促进基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-9表达升高而抑制TIMP表达，促进ECM合成，并且有强烈的致纤维化作用[12]。氧化应激能诱导成纤维细胞增殖及ECM的分泌，是激活TGF-β1的重要启动因素，与下游的关键受体Smads蛋白共同调控心肌纤维化。本实验通过Western blot及免疫荧光检测各组大鼠心肌组织TGF-β1的表达发现，TGF-β1的表达随依达拉奉干预剂量增加而减少；氧化应激促进TGF-β1表达，导致心肌纤维化，而依达拉奉具有抑制TGF-β1表达，减轻心肌纤维化的作用。经相关分析，CVF和LVMI均与TGF-β1呈正相关，这与Meredith等[13]研究结果一致。本研究中，中剂量组和高剂量组的依达拉奉显示了具有较明显的抗心肌纤维化作用，但其最优剂量需要进一步探讨。

综上所述，本研究初步表明，依达拉奉具有减轻氧化应激、抑制TGF-β1的表达进而发挥抗心肌纤维化的作用，为心血管疾病的防治提供了新的思路，值得进一步研究。

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（2015-04-29收稿2015-09-08修回）

（本文编辑李鹏）

Effects of edaravone on the expression of TGF-β1andmyocardialfibrosis in rats

WANG Shixiang，WUhongchao，LIU Yingfeng△
Department of cardiology, Zhujianghospital, Southernmedical University, Guangzhou 510280, China
△Corresponding Author E-mail：2415140659@qq.com

Abstract：Objective To investigate the effects of edaravone onmyocardial fibrosis induced by isoproterenol (ISO) in rats, and to discuss the correlation between the level of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and themyocardial fibrosis.Methods Fortymale SD rats were randomly divided into five groups, namely control group,model group and edaravone groups (low,medium andhigh doses).Isoproterenol was used to establish the ratmodel ofmyocardial fibrosis.Edaravone groups were given edaravone [3, 5 and 10mg/(kg·d)] to intervene for 14 days.The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level ofmalondialdehyde (MDA) were examined after 15-d treatment.The left ventricularmass index (LVMI) and collagen volume fraction (CVF) were examined.The expression of TGF-β1was detected by Western blot assay and immuno⁃fluorescencemethod.Results The content ofmDA and LVMI were significantlyhigher inmodel group than those of the control group (P < 0.01)，whereas the content of SOD was significantly lower inmodel group than that of the control group (P < 0.01).Compared withmodel group, the expression level ofmDA decreased with the increased intervention dose of edara⁃vone (P < 0.05), while SOD expression level increased (P < 0.05).There was no significant difference in the level of SOD be⁃tweenmiddle dose edaravone group and the control group.LVMI was decreased with the increased doses of edaravone (P < 0.01).There was no significant difference in LVMI between thehigh dose of edaravone group and the control group.Com⁃pared with the control group, the expression level of TGF-β1was significantly increased inmodel group (P < 0.01).The ex⁃pression level of TGF-β1was reduced with the increased doses of edaravone.CVF was significantly increased inmodel group compared with that of control group (P < 0.001).CVF decreased with the increased doses of edaravone inmedium andhigh doses of edaravone groups, but they werehigher than that of control group (P < 0.01).TGF-β1 was positively correlated withmDA, LVMI and CVF (r=0.931, 0.879 and 0.930, P < 0.001).SOD was negatively correlated with TGF-β1(r= -0.892, P < 0.001).Conclusion Edaravone can relievemyocardial fibrosis by inhibiting oxidative stress and TGF-β1in rats.

Key words：oxidative stress；fibrosis；myocardium；transforming growth factor beta1；Edaravonebook=68,ebook=73心肌纤维化是多种心脏疾病终末期的共同病理改变，也是心功能由代偿期向失代偿期转换的关键环节[1]，它主要表现为Ⅰ型和Ⅲ型胶原比例的失调和含量增加。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达增加是诸多因素所致心室纤维化的共同通路。研究表明，氧化应激可以刺激心肌成纤维细胞中TGF-βl的表达[2]。依达拉奉为临床常用的一种新型自由基清除剂，能有效清除自由基，减轻氧化应激。既往有研究通过动物实验证实依达拉奉能抑制肺纤维化[3]。然而其是否能够通过清除氧自由基减轻氧化应激来抑制TGF-β1表达，进而发挥抗心肌纤维化的作用鲜见报道。本实验拟通过观察依达拉奉对异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠模型进行干预，探讨依达拉奉抗心肌纤维化的作用及其作用机制。

通讯作者△E-mail：2415140659@qq.com

作者简介：王世祥（1980），男，博士在读，主要从事慢性心力衰竭诊治与康复研究

中图分类号：R542.2+3

文献标识码：A

DOI:10.11958/58841

作者单位：南方医科大学附属珠江医院心内科（邮编510280）