iPS细胞的研究进展

随蓓蓓

摘 要 本文内容主要包括三个部分。第一部分，iPS细胞的定义、特征和医用价值。第二部分， iPS细胞诱导因子和诱导方法。iPS细胞诱导基因主要有四个：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。Oct4和Sox2在诱导重构iPS细胞的过程中是必须的， Klf4和c-Myc的作用则是改变染色质的结构，有利于Oct4和Sox2的结合，提高诱导成功的效率。方法一，使用逆转录病毒为载体，可能会因为外源基因插入细胞基因组，干扰了内源基因的表达，容易诱发癌症；方法二，使用转染质粒，用一种小分子物质代替以往使用的一种癌基因，就可以成功得到iPS细胞；方法三，无需逆转录病毒载体诱导产生iPS细胞，因此也就避免了使用逆转录病毒载体所带来的基因插入、整合、突变等问题。第三部分，国内和国外iPS细胞的研究进展。

关键词 iPS细胞 诱导因子 逆转录病毒 转染质粒

中图分类号：Q819 文献标识码：A

2006年日本科学家山中伸弥在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了iPS干细胞的研究。他们把Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、增殖能力、表观遗传修饰类，以及细胞分化等方面都表现出了与胚胎干细胞相似功能，他们将这类细胞命名为诱导多功能干细胞。2007年，科学家们运用相似的方法，通过病毒转导，将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4导入人的成纤维细胞，成功获得了人的iPS细胞。人iPS细胞的获得使人们开始将视线投向iPS细胞的医疗应用之中，运用iPS技术获得病人特异的iPS细胞，进行药物筛选或基因治疗。近年来对于IPS细胞研究，取得了很大的突破，这为组织工程提供了丰富的细胞来源。

与ES细胞相比，iPS细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎，因而具有更广泛的应用前景。iPS细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，iPS干细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。iPS干细胞在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等，在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现。

1 iPS细胞诱导外源基因和诱导方法

1.1 iPS细胞诱导外源基因

IPS细胞的建立主要是通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的外源基因导入已分化的细胞即宿主细胞中，在合适的培养条件下，这些已分化的细胞就会转化为iPS细胞。

iPS细胞诱导关键外源基因有四个，分别是： Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。

Oct4，是POU转录因子家族中的一员，是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子，能与含八聚体基序的DNA结合从而调控下游靶基因的转录。它主要表达于胚胎干细胞及生殖干细胞中，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。Sox2基因是编码转录因子的主控基因家族的一个成员。转录因子是与DNA结合并调节其他基因表达的蛋白质。癌症基因c-Myc，是一种人类最容易过度表现的致癌基因，它可以抑制ES细胞的分化，对某些成体干细胞的自我更新起到一定的作用。c-Myc基因的产物为62KD的磷酸化蛋白P62c-mgc，是由c-Myc基因的外显子2和3共同编码的由439个氨基酸组成的蛋白质，定位细胞核内，为核蛋白，依C-one编码产物，功能分类，c-Myc癌基因属核蛋白基因，具有转化细胞的能力，并具有与染色体、DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用。Klf4上皮锌指转录因子，是进来我们研究较多的Klf家族的成员，它能够通过与下游基因启动子区的Klf4结合元件相结合，从而直接调控下由基因的转录，是生物体内一个重要的转录因子，主要调节体外细胞的增生与分化。

生化及分子生物学研究发现，Oct4和Sox2基因对于胚胎干细胞多能性的维持具有非常重要的作用，在诱导重构iPS细胞的过程中是必须的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用则是改变染色质的结构，有利于Oct4和Sox2的结合，提高诱导成功的效率。

有研究表明，两个原癌基因Klf4和c-Myc可能在重编程宿主细胞增殖中起到一定的作用，加速了形成过程，提高了iPS细胞的诱导效率。一种推测是Klf4和c-Myc这两个因子共同作用，使宿主细胞发生了类似于癌化的转化。另一种猜测则认为c-Myc基因修饰了宿主细胞的染色体状态，活化了相关基因，从而使得重编程基因更接近于所必需的基因。第三种猜测则认为c-Myc基因的过表达可以促进DNA的复制，从促进外源重编程因子调控其重建其表观遗传状态，而Klf4可以刺激宿主细胞中Leftyl基因的转录，与Oct4和Sox2共同作用，在宿主细胞中表达胚胎干细胞的关键基因。因此， Oct4可能是重编程过程中唯一一个独立作用的因子，其他的因子可能只是起到了协同的作用。

1.2 iPS细胞诱导方法

1.2.1使用逆转录病毒为载体诱导产生iPS细胞

将分别携带来Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4外源基因的4种逆转录病毒转染已分化的宿主细胞，并在转染过程中添加维生素C等来提高iPS细胞的诱导效率。应用该方法诱导iPS细胞的特异性较高。缺点是，该方法可能会导致外源基因插入或者整合到宿主细胞基因组，从而干扰了内源基因的表达，容易诱发癌症。

1.2.2使用质粒为载体诱导产生iPS细胞

使用转染质粒的方法成功构建了小鼠iPS细胞。用一种小分子物质质粒代替以往使用逆转录病毒，包被Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4转录因子转入宿主细胞。与使用逆转录病毒为载体诱导产生iPS细胞。相比于以逆转录病毒作为载体，该方法能够避免外源基因插入细胞基因组，不容易造成外源基因插入整合的问题。但该方法要求实验条件较高，且转染效率低。

1.2.3使用其他载体诱导产生无外源基因插入的iPS细胞

将iPS细胞应用于临床治疗，存在着外源基因表达沉默以及插入引起基因突变的风险。因此，获得非外源基因插入的iPS细胞是目前研究的热点。体细胞被导入的外源基因诱导重编程为iPS细胞，使其表观遗传发生改变。以逆转录病毒为载体，诱导iPS细胞，外源基因容易插入或者整合到宿主细胞基因组，容易使生物体形成肿瘤。为了增加iPS细胞用于医学治疗的安全性，经过努力将外源基因载体做出了改进，避免使用病毒核酸序列，改用非整合基因传递方法。使用一些小分子或细胞可渗透蛋白作为载体诱导重编程。一些小分子，如丙戊酸钠，丁酸，5-氮胞苷等，都可以促进iPS细胞诱导。

获得无外源基因插入的iPS细胞主要有以下途径：

（1）使用不会整合到宿主细胞基因组DNA的载体来诱导细胞进行重编程；

（2）进行iPS细胞诱导时，使用整合载体，在得到iPS细胞以后再将宿主细胞整合载体取出来；

（3）使用RNA和蛋白诱导产生iPS细胞，取代使用核酸载体系统。

无外源基因整合的iPS细胞是通过采用腺病毒作为载体将小鼠胚胎成纤维细胞诱导成为多功能干细胞。腺病毒基因组无法在细胞内进行复制，因此不会整合入宿主细胞基因组中。使用腺病毒载体转染Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因，避免了使用逆转录病毒载体所带来的基因插入、整合、突变等问题。IPS细胞转染效率在非外源基因整合iPS细胞中约0.001%，而在整合外源基因的iPS细胞转染效率约0.1%-1%。这是因为，腺病毒载体所携带的外源基因在细胞内只能表达3～8天，维持时间较短，不足以完成表观遗传改变，所以转染成功率低。loxP位点整合依赖重组质粒递呈载体，该载体可以通过瞬时表达Cre重组酶将整合在基因组上的外源基因去除。

2 近年iPS 细胞的研究

2.1 国内 iPS 细胞的研究进展

2007年，裴端卿等利用反转录病毒载体向小鼠成纤维细胞导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四种基因，诱导得到iPS细胞。接下来，他们将小鼠脑膜细胞改造为iPS细胞。2010年，他们又发现在细胞培养液中添加维生素C可以提高诱导iPS的形成效率。这一发现，极大地促进了iPS在各个研究领域中的应用。

邓宏魁等人于2008年研究发现，两种因p53 siRNA和UTF1可以提高诱导iPS 细胞成功率。2011年，他们又用四个小分子组合加Oct4的方法诱导iPS 细胞，可以取代经典四因子中的三个因子Sox2，Klf4和C-Myc，诱导获得iPS细胞。

曾凡一研究小组在2009年共构建了37株iPS细胞系，将筛选后的细胞系，注入多枚四倍体囊胚，用以获得嵌合胚胎。在嵌合胚胎妊娠足月后，得到了嵌合体小鼠，并且这些嵌合体小鼠会产生第二和第三代后代。高绍荣研究小组在2011年利用相似的方法获得嵌合体小鼠，并且能够稳定遗传到第二代。后来，通过对第二代嵌合体小鼠采样分离细胞后，同样能够获得iPS细胞克隆集落。其小组研究还发现，下调Rcor2的表达可阻止胚胎干细胞的增殖，降低其多能性，影响iPS的诱导效率。但是，Rcor2的外源性表达则可促进iPS诱导，提高诱导效率。

2.2国外 iPS细胞的 研究进展

2006年，日本科学家山中伸弥首次利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多能性有关的调控基因（Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4），最后得到了具有类似于胚胎干细胞某些特性的多能干细胞。这是世界上首次得到iPS细胞，也是首次提出这个新的概念。在后续发表的研究文献报道中，Yamanaka等从4个转录因子（Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4）中去掉了肿瘤相关因子c-Myc，也成功获得iPS细胞。与此同时，俞君英研究小组用他们自己筛选出的4种转录因子（Oct4、Sox2，Nanog和Lin28）也成功实现了人类皮肤成纤维细胞诱导成为iPSCs。

2008 年，德国学者Kim JB等把Oct4，Sox2，c-Myc 和Klf4减少为2个内生因子，通过诱导神经细胞，成功获得 iPS细胞。后来，Schler HR研究小组有进一步将转录因子数目减少到只有一个，其研究小组将 Oct4 以逆转录病毒为载体导入到小鼠神经干细胞，成功获得iPS。

在最近的研究中，发现小鼠iPS细胞来源的畸胎瘤会在皮下空间引发同系小鼠的免疫排斥反应。相反的，皮肤和骨髓组织同系移植，或者iPS来源的肝脏和神经原细胞只表现除了有限的免疫反应或者无免疫反应。这些研究主要是针对畸胎瘤的免疫原性，组织来源的嵌合体小鼠和异位移植，但是缺少令人信服的临床研究。iPS细胞来源的肝细胞可以对受损肝脏进行细胞治疗，这是药物治疗无法比拟的。然而如何对iPS细胞进行精确体外分化，如何提高分化率，仍旧是困扰我们的又一项难题。尽管iPS细胞有着诱人的临床应用前景，但目前还存在着很多难关需要克服。因此，要获得安全性高、外源基因高效表达的诱导iPS 细胞，如何对iPS细胞进行体外分化，提高分化率，仍需我们继续努力。

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