基于UPLC-Q-TOF/MS法分析车前子生品和盐炙品化学成分研究＊

谷彩梅，王增绘，郑司浩，黄林芳

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

基于UPLC-Q-TOF/MS法分析车前子生品和盐炙品化学成分研究＊

谷彩梅，王增绘，郑司浩，黄林芳＊＊

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 100193）

目的：利用超高效液相串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）法分析车前子及其盐炙品的成分，比较盐炙前后药物化学成分种类和含量的变化，探究车前子炮制前后药效变化的物质基础。方法：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱；流动相：0.1%乙酸水-甲醇体系梯度洗脱；ESI离子源；负离子模式；基于Markerlynx分析软件，利用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘判别法（OPLS-DA）分析车前子盐炙前后指纹图谱的差异。结果：盐炙品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异 毛蕊花糖苷的含量相对生品高。京尼平苷酸和毛蕊花糖苷可作为化学标记物区分生品与盐炙品。结论：基于UPLC-Q-TOF/MS法建立了车前子炮制前后的化学成分分析方法。车前子盐炙后有效成分含量增加。本实验的研究成果对于研究车前 子盐炙的炮制原理具有重要意义，同时也为车前子盐炙品药效物质基础的阐明提供了重要依据。

车前子 盐炙车前子 UPLC-Q-TOF/MS 化学成分

车前子最早记载于《神农本草经》，为常用中药材，2015年版《中国药典》收载其来源于车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressssa Willd.的干燥成熟种子，性甘、寒，归肝、肾、肺、小肠经，具有清热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰的功效，临床上多用于热淋涩痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤肿痛和痰热咳嗽[1]。植物化学方面的研究表明，车前子中主要含有环烯醚萜类、苯乙醇苷类、黄酮类、多糖类、甾体类、三萜类、氨基酸及挥发油等化学成分[2-4]。现 代药理研究证实，车前子具有止泻、抗氧化、护肝、降压、抑菌、降低血清胆固醇等作用[5-7]。车前子炮制方法主要有炒制、酒炙、盐炙等[8]，2015版《中国药典》（一部）收载了车前子和盐炙车前子，规定京尼平苷酸、毛蕊花糖苷作为其指标成分。

中药材在炮制过程中所含的化学组分往往会发生一定变化。超高效液相色谱与质谱联用技术（Ultra Performance Liquid Chromatography-Q-Time Of Flight/Mass Spectrum，UPLC-Q-TOF/MS）具备高效分离能力和定性检测能力，在中药代谢组分分析等研究中已得到较多应用[9,10]。本研究首次采用该技术分析车前子炮制前后成分变化，结合Markerlynx 4.1软件进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonality Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA），探讨盐炙法对车前子炮制前后化学成分的影响，从化学成分角度阐述盐炙车前子增效的科学内涵和炮制机理，为临床用药提供科学依据。

1 仪器与材料

UPLC-Q-TOF/MS联用仪（Waters公司）；Mass-Lynx V4.1质谱工作站（Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）。甲醇（色谱纯，美国Fisher）；乙酸（色谱纯）。

车前子经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员和黄林芳研究员共同鉴定为车前科植物车前P. asiatica L.干燥成熟的种子，盐炙车前子为本研究室自行炮制，部分样品保存在中国医学科学院药用植物研究所标本馆。样品信息详见表1。

2 方法

2.1 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18；柱温30℃，流速0.25 mL·min-1，进样量2 μL；流动相A：0.1%乙酸水；流动相B：甲醇；梯度洗脱（0→1 min，95%-85%A；1→10 min，85%→0%A；10→13 min，0%→95%A）。质谱条件：电喷雾电离离子源（Electrospray Ionization，ESI），负离子模式检测，m/z离子扫描范围为50-1 200 Da。

2.2 供试品制备

车前子与盐水拌匀，室温下闷润，加热烘干。方法参考本课题组建立的一种盐炙车前子的新制备方法（专利申请号：2012104264211）。

表1 车前子药材列表

图1 车前子及其盐炙品UPLC-Q-TOF/MS谱图

按《中国药典》2015版车前子“含量测定”项下方法制备供试品溶液，精密称定车前子及其盐炙品粉末（过2号筛）1.0 g，置入具塞锥形瓶中，加入60%甲醇50.0 mL，称定重量。水浴加热回流2 h，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，取滤液过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.3 数据分析

基于MarkerLynx 4.1软件分析车前子生品及其盐炙品的质谱峰信息；利用PCA和OPLS-DA法找出化合物谱的差异，经分析得到化学标记物。

3 结果

3.1 车前子及其盐炙品总离子流图比较

由车前子及其盐炙品负离子模式下总离子流图（图1）可见，车前子盐炙前后化学成分变化显著。车前子盐炙品与车前子生品相比，盐炙品中的1、2、3、5、6号离子峰强度明显升高；4、7、8号离子峰强度明显降低；其余变化不明显。鉴别出1号峰为京尼平苷酸（tR=3.00 min，m/z 373.082 2），2号峰为毛蕊花糖苷（tR=5.25 min，m/z 623.329 1），3号峰为异毛蕊花糖苷（tR=5.55 min，m/z 623.324 5）。其余未鉴定出。

3.2 MarkerLynx结果分析

MarkerLynx 4.1统计分析结果如图2-图3所示。PCA结果能明显区分盐炙品与生品（图2）。盐炙品分布在二维图的中间左侧，生品分布在二维图的中间右侧。将两组样品中的化学成分峰信息进行OPLS-DA得到散点图（图3），散点图中两组数据的差异主要是由炮制前后成分的含量差异造成的。由此可见，盐炙前后的成分含量具有显著性差异。S型曲线两端的数据点代表样品中可信度最高的特征化合物。右上方d-f代表车前子生品中含量较高的化合物，左下方a-c代表车前子盐炙品中含量较高的化合物。点a（tR=5.23 min，m/z 623.328 2）、b （tR=2.99 min，m/z 373.082 4）、c（tR=2.99 min，m/z 747.081 5）、d（tR=11.08 min，m/z 277.121 9）、e （tR=11.25 min，m/z 279.140 2）、f（tR=6.57 min，m/z 713.791 6）是车前子盐炙品与生品相比差异显著的化学成分，可作为潜在的标记物并为车前子盐炙品与生品的鉴定提供依据。

图2 车前子生品与盐炙品负离子模式下OPLS-DA差异成分鉴别

图3 车前子盐生品与炙品OPLA-DA差异成分分析结果的散点图

4 讨论

通过PCA和OPLS-DA分析，发现车前子盐炙后差异显著的成分为京尼平苷酸（Geniposidic acid）和毛蕊花糖苷（Acteoside），即潜在标记物，建议作为区分盐炙品与生品的指标成分。

盐炒车前子炮制方法最早记载于清代《幼幼集成》中，“以青盐水炒七次，治小儿泄泻”。《神农本草经》记载有“车前子，味甘、寒、无毒，主气窿止痛，利水通小便，除湿痹，久服轻身耐老”。传统药方多用盐炙车前子，一是能益肝明目，兼润心肾；二是能泻肾浊，利尿而不伤阴，避免药方中补药之腻滞，与养阴补血药同用，相辅相成，能更好地发挥全方作用[11]。《中国药典》2015版规定，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷是车前子的指标成分。本实验中车前子在盐炙后京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量增加，而且盐炙品中异毛蕊花糖苷含量也增加。京尼平苷酸属于环烯醚萜类成分，毛蕊花糖苷及异毛蕊花糖苷属于苯乙醇苷类成分。现代药理研究表明，环烯醚萜及其苷类具有较强的抗氧化活性，其中，以京尼平苷酸活性最强[12]。因此，这可能是车前子盐炙后增效的物质基础。盐炙后的车前子兼润心肾，利尿而不伤阴，避免药方中补药之腻滞，这些作用可能是基于京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷含量增加而起效的。已有的研究对车前子炮制方法存在一定的争议[8,13]，本文研究是基于2015版《中国药典》收载的车前子炮制方法——盐炙法。本文研究方法表明，车前子生品与炮制品在化合物种类和含量上都有较大差异。

5 结论

本研究基于UPLC-Q-TOF/MS技术考察车前子炮制（盐炙）前后化学成分的变化，并通过化学计量学识别车前子盐炙前后有效成分变化，该方法能够直观和准确地反映其炮制前后化学成分的变化。研究表明，车前子盐炙后主要有效成分含量增加，为车前子炮制后用药提供了重要依据。筛选出最佳的炮制工艺为4%盐量，闷润90 min，160℃烘干35 min。

2015版《中国药 典》明确规定京尼平苷酸、毛蕊花糖苷为成分标准。基于本文的研究发现，异毛蕊花糖苷是炮制过程中含量变化明显的组分，对异毛蕊花糖苷含量标准的研究可以进一步完善车前子药材质量控制。中药材中诸多 成分都有光谱吸收的特征，因此，在液相与高分辨质谱联用的同时，可以联用光谱检测器，如PDA紫外检测器等。光谱检测器与质谱检测器的联用可以同时对一些重要的成分进行精确的定量和定性分析，在中药炮制方面会有更广泛的运用。

1 国家药典委员会.中国药典2015版(一部).北京:中国医药科技出版社, 2015： 68-69.

2 Romero A L, West K L, Zern T, et al. The seeds from Plantago ovata lower plasma lipids by altering hepatic and bile acid metabolism in guinea pigs. J Nutr, 2002, 132(6)： 1194-1198.

3 何永婷,朱贺年.车前子的研究进展.北方药学, 2011, 8(1)： 55-57.

4 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草:精选本(下册).上海:上海科学技术出版社, 1998： 1781.

5 王劭华,罗光明,曾金祥,等.中药车前子的化学成分及药理学研究进展.亚太传统医药, 2008, 4(9)： 133-135.

6 贾丹兵,孙佩江,孙丽滨.车前草的药理研究.中草药, 1990, 21(1)： 24-26.

7 张振秋,李锋,孙兆姝,等.车前子的药效学研究.中药材, 1996, 19(2)： 87-89.

8 李果,张的凤,王文凯,等.车前子炮制历史沿革.中药材, 2008, 31(5)： 776-779.

9 Li S L, Lai S F, Song J Z, et al. Decocting-induced chemical transformations and global quality of Du-Shen-Tang, the decoction of ginseng evaluated by UPLC-Q-TOF-MS/MS based chemical profiling approach. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(4)： 946-957.

10 高洋,陈海敏,徐继林,等. κ-卡拉胶寡糖的反相离子对-超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱研究.分析化学, 2009, 37(11)：1590-1595.

11 叶定江,张世臣.中药炮制学.北京:人民卫生出版社, 1999： 531-532.

12 Toda S, Miyase T, Arichi H, et al. Natural antioxidants.Ⅱ. Antioxidative components isolated from seeds of Plantago asiatica LINNE. Chem Pharm Bull, 1985, 33(3)： 1270-1273.

13 刘川玉,唐建红.车前子炮制方法和用法考析.中国中医药现代远程教育, 2010, 8(11)： 87.

Analysis on Chemical Compositions of Crude and Salt-processed Plantago asiatica L. by UPLC-Q-TOF/MS

Gu Caimei, Wang Zenghui, Zheng Sihao, Huang Linfang
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was aimed to investigate the changes of chemical compositions and contents of crude and salt-processed Plantago asiatica L. by the ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupoletime-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) in order to explore the material basis of effect changes before and after the processing. The chromatography separation was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18column with gradient elution of 0.1% water (acetic acid)-methanol. The mass spectrometry was equipped with electrospray ionization (ESI) source. The detection was under the negative ion mode. Based on the Markerlynx software, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLSDA) were used in the analysis of the differences on fingerprint before and after the salt-processing. The results showed that in the salt-processed P. asiatica L., the contents of geniposidic acid, acteoside and isoacteoside were higher than the crude material. Geniposidic acid and acteoside can be used as the chemical markers for thedifferentiation between the crude and salt-processed materials. It was concluded that the chemical composition analysis method based on UPLC-Q-TOF/MS was established on the study of crude and processed P. asiatica L. After salt-processing, the effective contents in P. asiatica L. were increased. The experiment results played an important role in the processing principle study of salt-processed P. asiatica L. It also provided important evidences for the interpretation of effective material basis on salt-processed P. asiatica L.

Plantago asiatica L., salt-processed P. asiatica L., UPLC-Q-TOF/MS, chemical composition

10.11842/wst.2016.01.013

R284.1

A

2014-08-27

修回日期：2015-10-27

＊ 国家自然科学基金委面上项目-中国医学科学院药用植物研究所资源中心项目（81274013）：西洋参不同产地品质相关“地理特异基因群”的发掘，负责人：黄林芳。

＊＊ 通讯作者：黄林芳，研究员，主要研究方向：中药资源学。

（责任编辑：刘馨雨 张志华，责任译审：王 晶）