银杏外种皮提取物重金属元素与银杏酸测定＊

王 俊，尹 萌，韩东冬，茅蕾蕾，许爱华＊＊

（1.扬州大学医学院 扬州 225001；2.江苏省扬州市药品检验所 扬州 225009）

银杏外种皮提取物重金属元素与银杏酸测定＊

王 俊1，尹 萌2，韩东冬1，茅蕾蕾1，许爱华1＊＊

（1.扬州大学医学院 扬州 225001；2.江苏省扬州市药品检验所 扬州 225009）

目的：本研究旨在检测银杏外种皮提取物（Ginkgo Biloba Exocarp Extracts，GBEE）中，5种重金属元素和银杏酸的含量。方法：实验采用水提醇沉法制备6个不同产地的GBEE；采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定铅、镉、铜、砷4种重金属元素含量，原子荧光光度法（AFS）测定汞元素含量；采用HPLC 法检测银杏酸含量。结果：6个产地的 GBEE 中，铅、镉、铜、砷、汞的含量均在《中国药典》限量水平以下；且均不含任何银杏酸。结论：GBEE中不含银杏酸成分，其重金属元素含量符合《中国药典》限量规定。

银杏外种皮提取物 重金属元素 银杏酸

银杏是中国的特产，银杏的果实白果和银杏叶皆具有重要的药用价值而早已载入了《中国药典》。银杏外种皮是银杏果实的最外层肉质皮，目前在产区尚属废弃之物。GBEE为采用银杏外种皮经水煮、醇沉精制而得，主要有效部位为蛋白多糖类化合物[1]。本课题组已有的药效学研究显示，GBEE 具有促进免疫、抗肿瘤、抗肿瘤转移以及减毒增效等作用[2-5]。临床观察显示，其胶囊制剂可使胃癌瘤体缩小，并能改善多种癌症患者的生存质量，具有很好的应用前景[6]。本研究检测不同产地GBEE中的5种重金属元素以及银杏酸含量，为评估其安全性以及质量标准的建立提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Elan DRC-e电感耦合等离子体质谱仪（美国Perkin Elmer公司）；AFS-2202a 双道原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）；Multiwave 3000微波消解系统（奥地利Anton Paar公司）；Waters高效液相色谱仪，包括：Alliance 2695四元泵，Waters 2996 PAD检测器；R206型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；BT125D 型1/10 万电子天平（德国sartorius公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore 公司）。

1.2 材料

银杏果实于2013年10月上旬分别采摘于江苏泰州泰兴（1号）、江苏泰州姜堰（2号）、江苏南通（3号）、江苏无锡（4号）、安徽黄山（5号）、山东临沂（6号），经扬州大学医学院中医药研究室陈华圣教授鉴定均为银杏科银杏属植物银杏的成熟果实，其肉质外种皮徒手剥离，晒干备用；铅（Pb）、镉（Cd）、铜（Cu）、砷（As）、汞（Hg）5种单元素标准溶液均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；硝酸、过氧化氢（美国Sigma公司）；超纯水由Milli-Q超纯水处理系统制备；总银杏酸A（包括银杏酸C13：0、C15：1、C17：1）和总银杏酸 B（包括银杏酸C15：0、C17：2）皆为中国药品生物制品检定所提供；无水甲醇、冰醋酸为色谱纯；石油醚为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 GBEE的制备

采用水提醇沉法[7]制备GBEE。将6个不同产地的银杏外种皮按1：8（W：V）料液比加水于90-95℃煎煮提取，每次1 h，重复提取3次，过滤，合并滤液，将过滤液减压浓缩至一定的浓度后乙醇沉淀，乙醇终浓度为80%，收集沉淀物，用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥，即得灰白色GBEE粉末，其平均得率为5.04%。

2.2 重金属元素测定

2.2.1 标准溶液的配制

精密量取各单元素标准溶液，用稀释溶液逐级稀释配制成相应的系列浓度的溶液。

2.2.2 样品溶液的制备

精密称取6个不同产地GBEE样品粉末各0.5 g，置聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL浓硝酸放置过夜，次日加入3 mL过氧化氢，将消解罐加盖组装放入微波消解炉中，程序升温至180℃消解30 min取出，放冷后将消解液转移到100 mL容量瓶中定容，摇匀，即得GBEE样品溶液。同时制备空白试剂对照溶液。皆1式3份，供ICP-MS/AFS测定。

2.2.3 仪器工作参数

ICP-MS：高频发射功率1 350 W，采样深度6.6 mm，载气流量1.2 L·min-1，等离子气流量15 L·min-1，辅助气流量1.0 L·min-1，雾化室温度2℃，溶液提升量0.8 mL·min-1，扫描方式跳峰，观测点/峰3，每点积分时间0.3 s，重复次数3。AFS：光电倍增管负高压300 V，原子化器温度200℃，原子化器高度8 mm，灯电流30 mA，载气流量400 mL·min-1，屏蔽气流量1 000 mL·min-1。

2.2.4 方法学考察

线性关系和检出限：精密量取各单元素的系列标准溶液，在“2.2.3”相应的实验条件下测定，以ICP-MS/AFS为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），仪器自动处理数据，得到各元素的回归方程。结果表明，各元素在其相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.999 00-0.999 99 之间。将“2.2.2”项下处理过的空白对照溶液按与样品溶液相同的方法测定10次，以测定值的3倍标准偏差所对应的浓度值作为各元素的检出限，见表1。

精密度：分别精密量取各单元素标准溶液，在“2.2.3”相应的实验条件下重复测定6次，RSD在0.98%-6.95%之间。结果表明，所用仪器的精密度良好。

加样回收率：精密称取1-6号GBEE各0.25 g（6份），分别精密加入3个浓度水平的各单元素标准溶液，每个浓度系列平行2份，按“2.2.2”方法制备样品溶液，在“2.2.3”相应的实验条件下测定。结果显示各元素的平均回收率在 96.12%-105.59%之间，RSD均小于5.0%。

2.2.5 GBEE样品中重金属元素测定

取“2.2.2”项下样品溶液，按“2.2.3”项下相应的实验条件测定，计算各元素含量。结果显示，6 个产地的 GBEE 中Pb、Cd、Cu、As、Hg的含量均低于《中国药典》（2010 版）一部对药材的限量规定（铅≤5.0 mg·kg-1、镉≤0.3 mg·kg-1、铜≤20.0 mg·kg-1、砷≤2.0 mg·kg-1、汞≤0.2 mg·kg-1[8]）。结果还显示，在6个产地中，泰州地区（1号和2号）的GBEE中5种重金属元素含量皆低于6个产地的平均含量，见表2。

表1 GBEE 样品中各元素回归方程和检出限

2.3 银杏酸测定

2.3.1 色谱条件

ODS C18色 谱 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温25℃；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液（V：V，86.5：13.5），流速1.0 mL·min-1；检测波长为310 nm。

2.3.2 银杏酸标准品的定位谱图

精密称取总银杏酸A 2.5 mg，总银杏酸B 5.0 mg，分别溶于无水甲醇，定容于25 mL棕色容量瓶中，量取等体积的总银杏酸A甲醇溶液和总银杏酸B甲醇溶液，混合均匀，0.45 μm 滤膜过滤，得定位标准品甲醇溶液。精密量取100 μL 进样，在“2.3.1”色谱条件下检测，结果显示，5 种银杏酸均得到了较好的分离，见图1。

2.3.3 GBEE样品中银杏酸的检测

分别精密称取6个不同产地GBEE各1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入石油醚（60-90℃）50 mL，称定重量，回流提取2 h，放冷，再称定重量，用石油醚（60-90℃）补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，减压回收溶剂至干，精密加入无水甲醇2 mL，密塞，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，得GBEE样品甲醇溶液。在“2.3.1”色谱条件下进样100 μL，参照总银杏酸定位标准品谱图的出峰时间判断，结果显示，GBEE中不含任何银杏酸成分，见图2。

3 讨论

重金属元素生物毒性较大，进入人体后富集于某些器官中可导致一系列急慢性疾病[9]，《中国药典》对部分中药中Pb、Cd、Cu、As、Hg等重金属元素的限量皆有明确规定[10]。因此，重金属元素检测已经成为控制相关中药质量的常规项目。本研究采集华东地区6个产地的银杏外种皮，并按相同工艺制备了GBEE，采用ICP-MS/AFS法[11，12]检测了5种重金属元素，结果显示，6种GBEE中Pb、Cd、Cu、As和Hg元素的含量均符合《中国药典》安全标准，尤其是江苏泰州地区的GBEE，其5种重金属元素的含量均低于所测6个产地的平均值，可能与有银杏之乡美誉的生态环境有关。该结果为GBEE质量标准的进一步研究与制订提供了科学依据，也为银杏外种皮药用资源产地的选择提供了参考。

目前临床广泛用于治疗心脑血管疾病的银杏叶制剂其活性成分主要为黄酮和内酯，其中含有的少许银杏酸由于具有胚胎毒性、细胞毒性和免疫毒性等生物毒性，被公认为是其主要毒副作用成分，其含量为银杏叶提取物及其制剂质量标准中的主要控制指标[13，14]。很多研究结果皆显示，银杏外种皮中的银杏酸的含量高于银杏叶。本实验所制备的GBEE以银杏外种皮为原料，但其主要工艺与银杏叶制剂不同，是将银杏外种皮通过沸水煎煮、乙醇沉淀而得，主要活性成分是不溶于乙醇的蛋白多糖类化合物。由于乙醇是提取银杏酸的主要试剂之一[15]，考虑到乙醇溶剂的残留问题，检测GBEE中是否含有少许银杏酸很有必要。本研究采用HPLC法检测了6个不同产地的GBEE，结果显示均不含有任何银杏酸成分，可能与制备过程中对GBEE沉淀物使用高浓度乙醇进行了反复离心洗涤有关。该结果提示，采用该工艺制备的GBEE及其制剂在质量控制方面可以不考虑银杏酸检测项目。

表2 GBEE样品中重金属元素含量（n=3，mg·kg-1）

图1 总银杏酸标准品HPLC图

图2 GBEE样品HPLC图

1 吴倩,许爱华,杨茜,等.银杏外种皮提取物有效部位GBEE-2对胃癌SGC-7901细胞凋亡及其通路的影响.中药新药与临床药理, 2011, 22(3)： 270-273.

2 李俊,傅恩赐,许爱华,等. GBEE 对荷瘤小鼠 IL-2、IL-12、TNF-α 及TGF-α水平的影响.中国免疫学杂志, 2012, 28(5)： 415-417.

3 Xu A H, Chen H S, Sun B C, et al. Therapeutic mechanism of ginkgobiloba exocarp polysaccharides on gastric cancer. World J Gastroenterol, 2003, 9(11)： 2424-2427.

4 沈婷婷,许爱华,郑媛媛,等.银杏外种皮提取物对C57BL/6J小鼠Lewis肺癌转移的抑制作用及其机制.中国药理学与毒理学杂志, 2013, 27(1)： 67-71.

5 陈颖,茅蕾蕾,胡碧原,等.银杏外种皮提取物联合顺铂对S180荷瘤小鼠抗肿瘤增效减毒作用. 中国新药杂志, 2014, 23(13)： 1569-1573.

6 陈华圣,翟范,褚云飞,等.银杏外种皮多糖胶囊制剂治疗中晚期上消化道恶性肿瘤的临床研究.中西医结合学报, 2003, 1(3)： 189-191.

7 许爱华.具有抗肿瘤及免疫促进活性的银杏外种皮提取物及其有效部位的制备方法.中国, 201010251050. 9, 2010-12-15.

8 国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:中国医药科技出版社, 2010： 70, 96, 122, 205, 283, 306-308,附录49-50,附录67-69.

9 梁晓艳,唐秀能,胡军高,等.复方扶芳藤合剂中重金属元素测定及其安全性评价.中成药, 2013, 35(10)： 2189-2195.

10 谢达温,廉源沛,梁文琳,等.微波消解-ICP-MS法测定川芎和天麻药材中5种重金属元素. 世界科学技术-中医药现代化, 2015, 17(3)： 740-743.

11 于娟,杜守颖,陈珏. ICP-MS测定片仔癀肝宝中6种重金属的含量.世界科学技术-中医药现代化, 2014, 16(8)： 1789-1795.

12 汪洪.冷原子吸收光谱法和原子荧光光谱法检测粮食中有害元素——汞的分析方法之比较.粮食加工, 2006, 31(5)： 87-88.

13 李转梅,张学兰,李慧芬,等.白果不同部位及不同炮制品中白果酸和总银杏酸定量比较.中成药, 2015, 37(1)： 164-168.

14 田紫平,喻微,何贵州,等. HPLC 测定银杏叶中总银杏酸的含量.微量元素与健康研究, 2015, 32(2)： 36-37, 47.

15 王国艳,朱晶晶,楼凤昌.银杏外种皮的化学成分及其对植物真菌的抑制作用.中国药科大学学报, 2014, 45(2)： 170-174.

参考文献

Determination of Heavy Metal Elements and Ginkgolic Acid in Ginkgo biloba Exocarp Extracts

Wang Jun1, Yin Meng2, Han Dongdong1, Mao Leilei1, Xu Aihua1
（1.Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China; 2.Jiangsu Yangzhou Institute for Drug Control, Yangzhou 225009, China）

This article was aimed to detect the content of 5 heavy metal elements and the ginkgo acid in the Ginkgo biloba exocarp extracts (GBEE). GBEE from six different areas were prepared by water extraction and alcohol precipitation method. The Pb, Cd, Cu, as 4 kinds of heavy metal elements were detected by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）. The Hg was detected by atomic fluorescence spectrometry (AFS). The content of ginkgolic acid was detected by the HPLC method. The results showed that the content of Pb, Cd, Cu, Hg and As were all lower than the limit of the Chinese Pharmacopoeia in the GBEE from 6 Ginkgo biloba growing areas. In addition, GBEE did not contain any component of ginkgolic acid. It was concluded that GBEE from six different areas contained no ginkgo acid, the content of 5 heavy metal elements conformed to the limited provisions.

Ginkgo biloba exocarp extracts, heavy metal elements, ginkgolic acid

10.11842/wst.2016.01.011

R284

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：许爱华）

2015-09-29

修回日期：2015-09-29

＊ 江苏省科技发展计划医药高技术研究基金项目（BG2007609）：抗肿瘤创新药物GBEE的临床前研究，负责人：许爱华。

＊＊ 通讯作者：许爱华，教授，硕士生导师，主要研究方向：肿瘤药理学与中药分析。