微生物淋滤在重金属污染土壤修复中的研究进展*

彭昌盛 孟 柯 臧小龙 谷庆宝 袁合涛

(1.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012)

密度大于5.0 g/cm3的金属统称为重金属，约有45种[1]。易造成环境污染的重金属主要包括生物毒性较大的Hg、Cr、Pb、Cd及准金属As等，同时也包括Cu、Zn、Co等毒性相对较小的常见金属[2]。我国现阶段工业化和城市化快速发展，重金属排放行业越来越多，对土壤造成了严重的污染。据环境保护部的调查报告显示，我国土壤重金属污染严重，在调查的14 278个点位中，Hg、Pb、Cd、Ni、Zn、Cr、Cu、As 8种重金属点位超标率分别为1.6%、1.5%、7.0%、4.8%、0.9%、1.1%、2.1%、2.7%，全国约1/5的耕地受到了不同程度的重金属污染[3]。

土壤中重金属具有隐蔽性、滞后性、累积性、形态多样性等特点[4]211-212，仅依靠环境自净能力很难去除。因此，必须采取适当措施，才能实现重金属污染土壤的有效治理。传统的重金属污染土壤修复技术如固化/稳定化、化学淋洗、电动修复等虽有一定效果，但成本高、操作复杂且易形成二次污染，因此局限性较大。生物修复是指利用生物作用减少土壤中重金属含量或通过改变重金属在土壤中的存在形态来降低其毒性的土壤重金属修复方法[5]672，包括植物修复、动物修复和微生物修复。大多数重金属富集植物只能富集1～2种重金属，且修复过程缓慢；动物修复的动物种类更加有限，对环境适应性较差且修复效率低[6]7369；常用的微生物修复如微生物吸附往往会带来潜在的二次污染，因此研究廉价、高效的修复方法显得尤为重要。

微生物淋滤是指利用自然界中某些微生物与土壤中重金属发生直接或间接作用，通过氧化、还原、络合等反应将土壤中重金属分离、提取出来的一种技术。该技术成本低、对环境扰动小、不会造成二次污染，相对于化学淋滤，成本可降低约80%，有较好的规模化应用前景，因此近年来得到研究者的广泛关注。

1 微生物淋滤的起源与现状

微生物淋滤起源于微生物湿法冶金。1670年力拓矿业公司从矿坑水中回收微生物浸出的Cu标志着微生物浸矿的开始[7]251。1922年科学家首次提出使用细菌浸出硫化矿物中的Fe和Zn[8]。20世纪50年代，美国肯尼科特铜业公司对铜矿的大规模浸出标志着微生物湿法冶金技术开始实现工业化应用[7]253。至2006年，全世界超过20%的Cu是通过微生物湿法冶金技术得到的[9]90。微生物湿法冶金在工业应用上主要有堆浸、地浸、搅拌浸出和渗滤浸出4种方式，在浸出过程中要根据矿物的物化特性、品级等选择合理的浸出方式。

目前，微生物湿法冶金技术已广泛应用于矿物开采。20世纪90年代起，一些学者逐渐将这一技术运用到环境领域，用来淋滤矿物废渣、污泥、飞灰、废弃蓄电池、电子废弃物、海底沉积物、废弃催化剂以及污染土壤中的重金属，这样就产生了一门新的土壤重金属修复技术，即微生物淋滤。起初，主要通过室内摇瓶实验来遴选重金属耐受性能强、淋滤效率高的菌种。然而，由于摇瓶体积较小，传质效果较差。一是不能满足微生物生长过程中对溶解氧的需求；二是处理量较小，与实际条件差异较大。因此，近年来一些学者开始使用搅拌式反应器和土柱进行微生物淋滤实验。搅拌式反应器在重金属污染土壤化学淋滤异位修复中应用广泛，它能使淋滤液与土壤在反应器中长时间充分混合，在处理量较大的情况下依然可以保持较高的淋滤效率[10]。CHEN等[11]利用容积为5 L、搅拌速度为200 r/min的搅拌式反应器进行污染土壤的重金属淋滤，结果表明，氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、排硫硫杆菌的混合菌对土壤中Cu、Pb、Ni、Zn的淋滤效率可分别达到99%、98%、92%、68%。土柱淋滤法是通过土壤柱淋洗的形式来去除污染土壤中的重金属，这种技术可进行土壤的动态修复，提高淋滤效率。ILYAS等[12]在10 kg土柱中加入2 L培养基，菌液以50 mL/min的速度循环进入土柱，结果表明，Zn、Al、Cu、Ni的淋滤效率分别可达到80%、64%、86%、74%。微生物淋滤与其他修复方法的优缺点比较如表1所示。

2 常用微生物

微生物淋滤通常选用自养微生物，以硫杆菌最为常用，因为它们在生长过程中无需添加有机碳源，可通过氧化单质硫或还原态硫化合物、铁化合物来满足自身的能量需求[16]，可降低成本。但是自养微生物大多只能在pH较低的环境中生存，而重金属污染土壤不仅pH较高，还缺少自养微生物必需的能源物质。异养微生物不仅可在较高pH环境中生存，还可利用土壤中溶解性有机质作为营养物质，使得异养微生物也越来越受到研究者们的关注。

2.1 自养微生物

表1 重金属污染土壤修复方法比较

自养微生物对毒性较大的重金属如Cd、Cr、Pb、Ni等具有较好的去除效果，它们在土壤淋滤过程中可通过生长代谢直接或间接地与重金属发生氧化还原反应，促进重金属的淋滤，可降低土壤中残余重金属的毒性[9]103-106。NARESHKUMAR等[17]利用氧化硫硫杆菌从重金属污染土壤中成功淋滤出Cd、Cr和Pb。BAYAT等[18]从污泥中分离出的氧化亚铁硫杆菌对重金属Ni、Cd、Pb也具有很好的淋滤效果。PATHAK等[19]使用铁氧化菌淋滤重金属污泥发现，52%(质量分数，下同)的Cr和58%的Ni被成功淋滤出来。GUVEN等[20]用氧化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌的混合菌对Cr、Pb污染土壤进行淋滤，68%的Cr和72%的Pb被成功淋滤出来。另有研究表明，自养微生物在特定条件下对于一些不常见的重金属如V、Co、Sr等也有一定的去除效果[21-22]。目前，自养微生物只适用于修复有机质含量较低的污染土壤，当土壤中有机质含量较高时，一些低分子量水溶性有机质会对氧化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌等自养微生物产生毒性[23]，从而降低淋滤效率。

2.2 异养微生物

有研究发现，很多异养微生物也有很高的重金属耐受性[24]，因此近年来很多研究者开始将异养微生物应用于土壤重金属淋滤中。芽孢杆菌和假单胞杆菌可有效淋滤出非硫化物中的重金属[25]。真菌中，曲霉菌和青霉菌种类繁多且重金属耐受性较强，因此在土壤重金属微生物淋滤中应用较为广泛[26]。这些真菌可以产生大量的有机酸如柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等，其中黑曲霉菌是最具优势的菌种，它不仅对于常见的重金属如Cd、As、Cr、Pb具有良好的淋滤效果，同时还能淋滤出Zn、Cu、Mo等。REN等[27]从重金属污染土壤中分离出一株重金属耐受性较强的黑曲霉菌并将其运用于土壤重金属淋滤，结果发现，97.5%的Cu、88.2%的Cd、26%的Pb、14.5%的Zn被成功淋滤出来。QU等[28]73-76使用黑曲霉菌淋滤出84%的Pb、50%的Ni、44%的As、26%的Cr。AMIRI等[29]使用黑曲霉菌对废渣中Mo、Ni进行淋滤，也取得了很好的淋滤效果。近年来，随着研究的深入，越来越多的真菌被筛选出来用于土壤重金属淋滤。DENG等[30]从冶炼厂废渣污染土壤中分离出一株产黄青霉菌并应用于污染土壤修复，淋滤出62.8%的Cd、55.5%的Cu、53.9%的Zn、14.4%的Pb。BHARADWAJ等[31]利用布氏酸菌淋滤出了废渣中全部的Mo和Ni。

3 淋滤机制

重金属在土壤中以不同形态存在，一般分为可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机态、残渣态，其中前两种形态的重金属迁移能力较强且生物有效性较高，更易对动植物造成危害。微生物在淋滤过程中可通过代谢活动改变重金属形态，达到去除或转化的目的，主要包括酸解络合、氧化还原及甲基化和去甲基化作用。

3.1 酸解络合作用

微生物生长过程中，可利用底物或代谢过程中产生的中间产物产生不同种类的有机酸，如葡萄糖酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸等[28]74-75,[32]，这些有机酸提供配位基团与重金属离子发生络合反应以提高土壤中重金属的淋滤效率。有报道指出，有机酸的释放还可以减弱土壤与重金属的联结，加快土壤表面重金属的淋出[33]。DENG等[34]使用产黄青霉菌在5%土液比条件下进行淋滤实验，15 d后产生了葡萄糖酸102.2 mg/L、草酸156.4 mg/L、丙酮酸191.6 mg/L、琥珀酸70.6 mg/L，Cd、Pb、Zn、Cr的去除率分别达到74%、24%、55%、24%。QU等[35]利用三色青霉菌进行淋滤实验，50 d后发现，在10%土液比条件下该菌产酸量最多达到100 mmol/L，重金属淋滤效率也达到最高，Ra去除率为71%，Th去除率为77%。酸解络合作用主要发生在异养真菌进行土壤淋滤的过程中，在整个过程中，有机酸占据了核心位置，不仅能够提供质子，同时还提供了与重金属离子配位的有机酸阴离子。

3.2 氧化还原作用

土壤重金属淋滤过程中，硫杆菌如氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌及排硫硫杆菌可通过氧化还原作用，使重金属形态发生变化，从而改变重金属的稳定性或生物有效性。以氧化亚铁硫杆菌为例，可分为直接淋滤(见式(1)，其中M表示重金属，下同)和间接淋滤(见式(2)至式(4))两种机制。在直接淋滤过程中，氧化亚铁硫杆菌通过分泌胞外多聚物与金属硫化物直接接触，利用细胞内特有的氧化酶直接氧化金属硫化物，使得体系中难溶性重金属逐渐转变为可溶性的硫酸盐；在间接淋滤过程中，氧化亚铁硫杆菌可将底物中的Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+与金属硫化物发生氧化还原反应，Fe3+又被还原为Fe2+，并生成单质硫，单质硫可被细菌氧化成硫酸，而金属硫化物以硫酸盐的形式溶解出来，最终形成一个氧化还原循环系统[36]。CHEN等[37]研究发现，污泥中 Cu、Pb和Zn经氧化硫硫杆菌微生物淋滤后碳酸盐结合态比例明显减少。张军等[38]从某矿的酸性矿井水中分离出一株氧化亚铁硫杆菌并将其用于微生物淋滤，Zn、Pb、Ni、Cd、Cr的淋滤效率分别达到93.56%、46.54%、85.48%、90.64%、45.15%。NARESHKUMAR等[39]研究发现，土著氧化硫硫杆菌对于Zn、Cd、Cu、Cr的淋滤效率都超过了85%。

(1)

2Fe2++1/2O2+2H+→2Fe3++H2O

(2)

MS +2Fe3+→M2++2Fe2++S

(3)

2S+3O2+2H2O→2H2SO4

(4)

还有一些细菌对Cr(Ⅵ)、As5+等高价态重金属离子具有还原作用，如棒状杆菌、微球菌、产碱杆菌等可将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)[40]；Geospirillumarsenophilus、Geospirillumbornseii、Chrysiogenesarsenatis可在厌气条件下将As5+还原成As3+[41]。

3.3 甲基化与去甲基化作用

根据不同的修复目的，微生物可通过酶促反应使烷基和重金属元素结合或分离，从而改变重金属在土壤中的存在形态，其中以Hg的甲基化和去甲基化最为典型。Hg是生物非必须的有毒重金属元素，其毒性与其在土壤中的形态紧密相关。甲基汞的去甲基化可使土壤中甲基汞的含量减少，Hg的毒性降低100多倍[42]。土壤微生物可通过有机汞裂解酶(MerB)将甲基汞还原为Hg(Ⅱ)，又可通过还原酶(MerA)将Hg(Ⅱ)还原为单质汞，使其进入大气进行全球循环。另一方面，土壤中存在的硫酸盐还原菌、铁氧化菌、黑曲霉等则可通过酶促反应将甲基转移至Hg(Ⅱ)，形成甲基汞，有效降低土壤中汞的迁移性[43]。目前，甲基化与去甲基化作用主要存在于Hg污染土壤的微生物淋滤中，对于其他重金属污染土壤修复的研究还较少。

4 影响因素

4.1 pH

适宜的pH可以促进培养基中有机化合物的电离，使它们较易进入微生物体内，更有利于微生物的生长。另外，不同的微生物淋滤需要不同的pH，因此了解淋滤过程中pH的变化规律对于控制淋滤过程、提高淋滤效率具有重要意义。

微生物淋滤过程中pH下降越快，淋滤作用越强，淋滤效果越好[44]。李洁[45]研究了pH对黑曲霉菌淋滤土壤重金属的影响，发现初始pH=5.8条件下，pH下降幅度最大且淋滤效率最高。

4.2 温 度

温度对于淋滤过程中微生物的生长繁殖与代谢反应有显著影响[46]。温度太低，微生物生长代谢缓慢，不利于淋滤过程的进行，但温度太高，参加微生物代谢反应的酶会失活，从而影响土壤重金属的淋滤效率。崔雨琪等[47]在探究温度对黑曲霉菌生长特性影响时发现，黑曲霉菌在25～35 ℃下生长良好，低于20 ℃或高于40 ℃都会受到明显抑制。

4.3 土液比

土液比是指土壤质量与浸出液体积的比值，是影响淋滤效率的重要因素。土液比越高，土壤修复的经济效益越高，能够提供给微生物的养分也越多，理应更适宜微生物的生长，然而土壤成分复杂多样，土液比升高会提高土壤体系缓冲能力，不利于降低淋滤过程中的pH。另外，土液比升高，土壤释放出的重金属离子及有机质浓度随之升高，过高的重金属离子浓度会抑制微生物的生长代谢甚至导致其死亡，而水溶性有机质则对自养微生物有一定的毒害作用，可能降低淋滤效率。任婉侠等[48]研究了黑曲霉菌对沈阳冶炼厂重金属污染土壤的淋滤效率，在5%土液比下淋滤效率最高，Cu、Cd、Pb、Zn的淋滤效率分别达到25.2%、98.3%、30.2%、15.7%。

5 展 望

尽管微生物淋滤具有良好的应用前景，但由于淋滤周期长、土壤成分及重金属形态复杂使得该技术目前尚处于实验室探索阶段。若想加快微生物淋滤技术在重金属污染土壤修复中的工程化应用，笔者认为，尚需在以下方面进行深入研究：

(1) 由于重金属对微生物的生长代谢具有毒害作用，因此只有找到高耐受性微生物，深入了解其细胞结构、遗传代谢，才能够显著促进微生物淋滤在重金属污染土壤修复中的应用。

(2) 微生物淋滤周期较长，淋滤过程会受到环境条件及淋滤方法的影响。针对不同微生物与不同土壤重金属，选择不同的淋滤方法，优化淋滤条件，缩短淋滤周期，提高淋滤效率。

(3) 重金属在土壤中的不同形态具有不同的生物有效性、毒性及迁移性。研究微生物与不同重金属形态之间的作用机制，有针对性地去除或转化土壤中毒性高、生物有效性高、迁移能力强的重金属形态。

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