肠道微生态在克罗恩病发病中的作用以及治疗前景

楼俪泓　曾　悦　王兴鹏*

上海交通大学附属第一人民医院国际医疗保健中心1(200080)　消化科2



肠道微生态在克罗恩病发病中的作用以及治疗前景

楼俪泓1曾悦2王兴鹏2*

上海交通大学附属第一人民医院国际医疗保健中心1(200080)消化科2

摘要克罗恩病(CD)的致病因素和发病机制至今尚未完全阐明，目前普遍认为其由遗传因素、免疫功能紊乱、肠道屏障功能障碍和肠道微生态改变等多因素所致。肠道微生态与CD发病的关系日益受到关注。多项证据表明CD患者存在肠道微生态改变，肠道微生态改变与CD发生相关，调节肠道微生态对CD有治疗作用。本文就肠道微生态与CD发病的关系以及治疗前景作一综述。

关键词肠道微生态；肠道菌群；炎症性肠病；Crohn病；治疗

Role and Therapeutic Prospect of Intestinal Microecology in Crohn’s Disease

LOULihong1,ZENGYue2,WANGXingpeng2.1InternationalMedicalCareCenter,2DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(200080)

Correspondence to: WANG Xingpeng, Email: richardwangxp@163.com

AbstractThe etiology and pathogenesis of Crohn’s disease (CD) are not fully clear, and genetic susceptibility, immunologic disorder, intestinal barrier dysfunction and intestinal microecology are considered to be involved in the pathogenic mechanism of CD. In recent years, the relationship between intestinal microecology and CD has received much attention. Several studies confirmed that the intestinal microecology in CD patients was different from that in normal person. The change of intestinal microecology was correlated with the occurrence of CD, and modulation of intestinal flora was effective in the treatment of CD. This article reviewed the relationship between intestinal microecology and CD and the therapeutic prospect of intestinal microecology for the treatment of CD.

Key wordsIntestinal Microecology;Intestinal Bacterial Flora;Inflammatory Bowel Disease;Crohn Disease;Therapy

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性消化道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)。IBD的病因和发病机制尚未明确，目前普遍认为其由遗传因素、免疫功能紊乱、肠道屏障功能障碍和肠道微生态改变等多因素所致[1]。肠道微生态研究肠道正常微生物群的结构、功能及其与宿主相互依赖和相互制约的关系，目前肠道微生态与IBD尤其是CD的关系日益受到重视。疾病时肠道微生态与宿主之间的平衡关系被打破，恢复肠道微生态的稳定可能成为治疗CD的重要方向之一。本文就肠道微生态在CD发病中的作用以及治疗前景作一综述。

一、肠道微生态的构成、功能和影响因素

肠道微生态由肠道菌群、肠黏膜上皮和肠黏膜免疫系统等组成，其中肠道菌群发挥最重要的作用，而肠黏膜上皮间的紧密连接、上皮细胞分泌的黏液以及肠黏膜免疫系统协同构成肠道黏膜屏障。人体胃肠道中的微生物总量超过1014，包括细菌、古细菌、真核生物、噬菌体和病毒[2]，其中细菌占99%以上，约1 000~1 150种[3]，以厚壁菌门和拟杆菌门最为常见，超过细菌总数的90%。

肠道内大量的共生菌在调节人体代谢、免疫和生长发育过程中起重要作用。①消化和吸收：肠道菌群为宿主提供了多条生化代谢通路，能发酵不被小肠吸收的食物残渣，为宿主和微生物本身提供能量和营养物质。厚壁菌门如梭菌和双歧杆菌分解食用纤维产生丁酸等短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)，为肠道上皮细胞提供能量[4]。无纤维饮食和无菌环境下，SCFAs产生减少，导致肠道营养不良和肠道萎缩。②宿主免疫功能和肠道上皮屏障功能：小鼠模型证实无菌导致多种免疫发育缺陷，肠道菌群定植的时间节点对保护宿主免疫细胞群的发展有至关重要的作用[5]。肠道固有细菌和SCFAs还可影响肠道黏膜免疫与肠道菌群的交互作用，具有调节结肠内T细胞的数量和功能、维持肠道内环境稳定的作用[6]。③肠道微生态影响机体能量代谢，并具有一定的可传递性。肥胖人群和遗传性肥胖小鼠中厚壁菌和拟杆菌增加，将肥胖小鼠的肠道菌群移植至无菌小鼠后，后者体质量增加[7]。

影响肠道微生态的因素包括环境因素和遗传因素。近期研究发现CD易感基因Nod2缺失小鼠的肠道菌群组成异常[8]；在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中，Nod2缺失小鼠的肠道菌群改变与肠道炎症严重程度呈平行关系[9]；Nod2和ATG16L1变异者柔嫩梭菌减少而大肠杆菌增加，从而证实了遗传基因对肠道菌群的影响[10]。由此可见，肠道微生态可决定宿主的表型，反之宿主基因型亦影响肠道菌群组成。同时，饮食、药物、宿主免疫状态、心理情绪变化以及肠道生理的变化也可影响肠道微生态。

二、CD肠道微生态的变化

随着DNA测序和数据分析技术的迅猛发展，对IBD肠道微生态的研究从对单一菌种的个体研究转变为对菌群的群体研究。IBD尤其是CD发生初期就存在肠道菌群失调现象，以厚壁菌减少和变形菌增加为代表[10]。CD患者粪便微生物的α多样性即物种丰度减少[11]，炎症组织中肠道菌群总体负荷量明显减少，以厚壁菌减少最为显著[12]，肠道优势菌群的稳定性减弱。甚至有研究建议可使用直肠黏膜肠道微生态的变化来早期诊断CD[13]。

肠道微生态的改变，包括菌群组成和功能的改变均与CD密切相关。CD中肠道微生物α多样性降低，拟杆菌和厚壁菌门减少，变形菌增多，大肠杆菌尤其是黏附侵袭性大肠杆菌在CD患者回肠活检组织中被分离出来，梭状芽孢杆菌、瘤胃菌(Ruminococcaceae)、双歧杆菌和乳杆菌和柔嫩梭菌减少；SCFAs如丁酸盐、丁酸甲酯和丙酸代谢减少，氨基酸合成减少，营养缺陷、氨基酸转运、硫酸盐转运、氧化应激、毒素分泌和Ⅱ型分泌系统增加[14]。

由于目前研究多采用16S rRNA基因表达谱测序技术，故大量非细菌微生物数据被忽略，然而这些非细菌微生物如真菌、病毒、古细菌和噬菌体在胃肠道疾病的发生中起有重要作用。真菌与IBD包括CD密切相关，CD中真菌的多样性增加[15]。肠道病毒组在CD患者中丰度增加，菌群的丰度和多样性减少无法解释病毒组的这一变化，病毒组的变化可能引起肠道炎症和菌群变化[16]。但非细菌微生物与CD的关系仍有待于进一步深入研究。

三、肠道微生态改变与CD发生相关

CD的发病部位多位于与细菌接触最多的肠道，使用广谱抗菌药物可改善肠道炎症。免疫缺陷的结肠炎动物模型在无菌环境下不会发生肠道炎症，但如重新恢复肠道菌群则可能出现肠道炎症[17]。CD时，致病菌和条件致病菌相对增多，活动期患者肠道共生菌数量减少至正常的1/10，尤其是硬壁菌和拟杆菌。肠道炎症改善与大肠杆菌/志贺杆菌的减少相关。有研究指出，耶尔森菌、普拉梭菌和假单胞菌与CD的发展有关[18]，难辨梭菌、弯曲杆菌、腺病毒、轮状病毒和支原体与CD的复发有一定关系。鸟分枝杆菌亚种副结核杆菌(Mycobacterilumaviumsubspecies paratuberculosis, MAP)一直以来被怀疑为CD的致病菌，但依据不足。虽然CD患者体内MAP相关的T细胞数量明显高于UC患者，从患者体内分离提取T细胞后可与MAP发生强烈反应。但MAP本就存在于人类食物链中，抗菌药物清除MAP仍不能使CD完全缓解。真菌在CD发病中的重要性尚未明确，血清酿酒酵母菌抗体为真菌在CD发病中的作用提供了一个支持点。

保护性菌群减少导致CD发展，细菌与肠黏膜组成有一定规律的菌膜屏障结构，能阻止病原微生物过度生长，限制其黏附于肠黏膜。拟杆菌和梭菌具有诱导Treg细胞扩散减轻肠道炎症的作用[19]。部分肠道细菌可通过调节NF-κB减少肠黏膜炎症，瘤胃菌、考拉杆菌和罗氏菌等产生的SCFAs具有诱导Treg细胞扩散的作用[19-20]，但CD患者上述细菌明显减少。

目前研究认为肠道微生态可能通过以下一种或多种途径参与了CD的发病：①菌群失调使肠道内致病菌增多，致病菌分泌的肠毒素使肠黏膜通透性增高，分泌的免疫抑制性蛋白可致黏膜免疫失调，增多的致病菌还可直接侵袭、损伤肠上皮细胞，破坏肠黏膜屏障。②肠黏膜屏障功能缺陷，通透性增高，使肠腔内的抗原、内毒素等促炎物质进入肠黏膜固有层，诱发异常免疫反应。肠黏膜通透性增高还可致肠道细菌及其产物易位，细菌产物进入肠肝循环，进一步损伤肠黏膜屏障。③肠道免疫功能异常，肠黏膜免疫系统对已发生变化的肠道菌群不能耐受。④肠道正常细菌的种类、数量和功能发生改变，影响肠上皮细胞能量代谢，导致上皮细胞受损，诱发肠道炎症反应。⑤某种特异性致病菌感染。

四、调节肠道微生态在CD治疗中的作用

1. 益生菌(probiotics)：微生态制剂已成为治疗IBD的一个新方向。益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌、其他产乳酸的细菌如乳球菌、链球菌，以及芽孢杆菌、拟杆菌、肠球菌、柔嫩梭菌和鲍氏酵母菌等非细菌性微生物。益生菌制剂的原料常源自人体，无致病性，能抵抗胃酸和肠道内消化酶的作用。益生菌能黏附于肠黏膜表面，通过抑制细菌黏附、易位或产生抗菌物质以拮抗致病菌，具有调节免疫应答、下调异常免疫反应、纠正菌群失调、稳定肠黏膜屏障与上皮间的紧密连接以恢复黏膜屏障、改善黏膜通透性、抑制促炎因子表达等作用。然而，目前尚缺乏充足证据证明益生菌可诱导CD缓解或对CD活动有治疗效果[21]。值得一提的是，所有得出益生菌无法预防CD复发的研究中均包含乳杆菌，而宣称有效的实验中均无乳杆菌参与。推测仅包含乳杆菌的益生菌无法减低CD复发风险。

2. 益生元(prebiotics)和合生元(synbiotics)：益生元包括不易消化的短链碳水化合物如低聚果糖、低聚半乳糖或更复杂的糖类化合物。益生菌与益生元的结合物称为合生元。共生菌可分解代谢益生元从而降低肠腔pH值并将益生元转变为SCFAs[22]。体外研究和动物模型证实益生元可促进有益菌群的生长和代谢，但益生元对CD疗效的临床研究非常少、样本小且缺乏统一的结果[23-24]。目前尚无关于益生元和益生菌治疗CD的安全性研究，有待进一步深入探讨，包括剂量反应性研究、设置研究变量如机体特性(年龄、性别、生活方式和依从性)、危险因素和疾病累及范围等。

3. 抗菌药物：抗菌药物在CD并发症如腹腔内脓肿、肛周脓肿和瘘管的治疗中起重要作用。目前缺乏广谱抗菌药物对活动性CD疗效的评估试验。利福昔明可减少CD治疗的失败率但不促进CD缓解，克拉霉素、利福布丁和氯法齐明治疗仅能增加短期缓解率[25]。

4. 粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)：FMT即将健康个体的粪便悬液注入结肠疾病患者肠道内。健康个体的粪便主要含双歧杆菌、类杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌，以双歧杆菌、类杆菌和乳酸杆菌为主。多项研究表明FMT在难辨梭菌感染的治疗中有效，现已逐渐应用于IBD的治疗。1988年，首次将FMT应用于UC患者，最终取得了临床和组织学的痊愈[26]。FMT对CD患者的疗效目前正在多项临床研究中开展，已发表的研究主要为个案报道、队列研究和meta分析，报道总数约38例，集中于难治性和活动性CD，随访时间1~12个月。经FMT治疗后共8例无改善，6例改善但未缓解，其余24例临床缓解[27-31]。FMT是近年才开展的新兴治疗方案，使用较局限，其作用机制、安全性和有效性还有待阐明。虽然该法简便，但研究CD肠道微生态治疗的最终目的是选择出可肠内给药的细菌组成，并阐述肠道微生态对肠黏膜免疫发展的作用，以及不同细菌的不同作用，制备不同功用的肠道微生物混合剂治疗包括CD在内的IBD和其他疾病。

五、肠道微生态和CD的研究方向

未来需进一步深入研究CD的遗传学、免疫反应和肠道微生态等。由于人体微生态的复杂性，各因素相互关联，对CD的发病原理、微生物和微生物代谢机制以及功能的研究数据有限，需多层面地对肠道微生态和CD进行系统研究，包括人体微生物群落和肠道微生态与机体免疫系统的相互作用关系的研究。肠道微生态和CD的研究可能会进入多组学研究，以全面论述宿主与微生物的关系。届时最佳化的标本采集、详细的临床资料和样本处理显得极为重要。研究对象应纳入机体、细菌、病毒和真核生物，协变量应包括宿主的基因组、疾病活动情况、治疗细节、饮食因素、年龄、性别、人种、标本类型、标本收集和抽提方式等。可针对粪便标本、活检或手术标本和血液标本进行一系列分析研究。如粪便标本微生物可行16S rRNA基因表达谱分析、宏基因组测序、宏转录组测序、代谢谱分析、单个细胞分析、病毒组DNA和RNA研究和蛋白质组学研究，对机体可进行粪钙卫蛋白测定。对活检或手术标本可针对肠道微生物行16S rRNA基因表达谱分析、分离细菌和宏基因组测序，对机体可行转录组学的测序和上皮细胞分析。血液标本可进行针对机体的亚硫酸盐测序、SNP测序和血清检查[14]。经系统研究预计能进一步阐明机体与肠道微生态的相互作用，并为CD的诊断和治疗发展提供新的机遇。

六、结语

综上所述，肠道微生态在IBD包括CD的发生中起极其关键的作用。现代分子生物学技术是一种可更好地了解CD肠道微生物特点的有力工具。随着对CD发生过程中肠道微生态认识的不断深入，可有助于更好地阐明其发病机制，并可能为将来对CD患者开展肠道微生态治疗提供依据。

参考文献

1 Maloy KJ, Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease[J]. Nature, 2011, 474 (7351): 298-306.

2 Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, et al. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota[J]. Nature, 2012, 489 (7415): 220-230.

3 Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature, 2010, 464 (7285): 59-65.

4 Thibault R, Blachier F, Darcy-Vrillon B, et al. Butyrate utilization by the colonic mucosa in inflammatory bowel diseases: a transport deficiency[J]. Inflamm Bowel Dis, 2010, 16 (4): 684-695.

5 Olszak T, An D, Zeissig S, et al. Microbial exposure during early life has persistent effects on natural killer T cell function[J]. Science, 2012, 336 (6080): 489-493.

6 Smith PM, Howitt MR, Panikov N, et al. The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis[J]. Science, 2013, 341 (6145): 569-573.

7 Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J]. Nature, 2006, 444 (7122): 1027-1031.

8 Rehman A, Sina C, Gavrilova O, et al. Nod2 is essential for temporal development of intestinal microbial communities[J]. Gut, 2011, 60 (10): 1354-1362.

9 Couturier-Maillard A, Secher T, Rehman A, et al. NOD2-mediated dysbiosis predisposes mice to transmissible colitis and colorectal cancer[J]. J Clin Invest, 2013, 123 (2): 700-711.

10Frank DN, Robertson CE, Hamm CM, et al. Disease phenotype and genotype are associated with shifts in intestinal-associated microbiota in inflammatory bowel diseases[J]. Inflamm Bowel Dis, 2011, 17 (1): 179-184.

11Manichanh C, Rigottier-Gois L, Bonnaud E, et al. Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn’s disease revealed by a metagenomic approach[J]. Gut, 2006, 55 (2): 205-211.

12Kang S, Denman SE, Morrison M, et al. Dysbiosis of fecal microbiota in Crohn’s disease patients as revealed by a custom phylogenetic microarray[J]. Inflamm Bowel Dis, 2010, 16 (12): 2034-2042.

13Gevers D, Kugathasan S, Denson LA, et al. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn’s disease[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15 (3): 382-392.

14Kostic AD, Xavier RJ, Gevers D. The microbiome in inflammatory bowel disease: current status and the future ahead[J]. Gastroenterology, 2014, 146 (6): 1489-1499.

15Ott SJ, Kühbacher T, Musfeldt M, et al. Fungi and inflammatory bowel diseases: Alterations of composition and diversity[J]. Scand J Gastroenterol, 2008, 43 (7): 831-841.

16Norman JM, Handley SA, Baldridge MT, et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease[J]. Cell, 2015, 160 (3): 447-460.

17陈玉霞, 詹学. 肠道菌群与炎症性肠病[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2014, 8 (8): 132-136.

18Nagalingam NA, Lynch SV. Role of the microbiota in inflammatory bowel diseases[J]. Inflamm Bowel Dis, 2012, 18 (5): 968-984.

19Atarashi K, Tanoue T, Oshima K, et al. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota[J]. Nature, 2013, 500 (7461): 232-236.

20Smith PM, Howitt MR, Panikov N, et al. The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis[J]. Science, 2013, 341 (6145): 569-573.

21Haag LM, Siegmund B. Exploring & exploiting our ‘other self’ - does the microbiota hold the key to the future therapy in Crohn’s? [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2014, 28 (3): 399-409.

22Koboziev I, Reinoso Webb C, Furr KL, et al. Role of the enteric microbiota in intestinal homeostasis and inflammation[J]. Free Radic Biol Med, 2014, 68: 122-133.

23Benjamin JL, Hedin CR, Koutsoumpas A, et al. Randomised, double-blind, placebo-controlled trial of fructo-oligosaccharides in active Crohn’s disease[J]. Gut, 2011, 60 (7): 923-929.

24Steed H, Macfarlane GT, Blackett KL, et al. Clinical trial: the microbiological and immunological effects of synbiotic consumption - a randomized double-blind placebo-controlled study in active Crohn’s disease[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2010, 32 (7): 872-883.

25Selby W, Pavli P, Crotty B, et al; Antibiotics in Crohn’s Disease Study Group. Two-year combination antibiotic therapy with clarithromycin, rifabutin, and clofazimine for Crohn’s disease[J]. Gastroenterology, 2007, 132 (7): 2313-2319.

26Borody TJ, Campbell J. Fecal microbiota transplantation: current status and future directions[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2011, 5 (6): 653-655.

27Suskind DL, Brittnacher MJ, Wahbeh G, et al. Fecal microbial transplant effect on clinical outcomes and fecal microbiome in active Crohn’s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2015, 21 (3): 556-563.

28Vaughn BP, Gevers D, Ting A, et al. Fecal microbiota transplantation induces early improvement in symptoms in patients with active Crohn’s disease[J]. Gastroenterology, 2014, 146 (5): S591-S592.

29Vermeire S, Joossens M, Verbeke K, et al. Pilot study on the safety and efficacy of faecal microbiota transplantation in refractory Crohn’s disease[J]. Gastroenterology, 2012, 142 (5 suppl 1): S360.

30Cui B, Feng Q, Wang H, et al. Fecal microbiota transplantation through mid-gut for refractory Crohn’s disease: safety, feasibility, and efficacy trial results[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2015, 30 (1): 51-58.

31Colman RJ, Rubin DT. Fecal microbiota transplantation as therapy for inflammatory bowel disease: a systematic review and meta-analysis[J]. J Crohns Colitis, 2014, 8 (12): 1569-1581.

(2015-04-27收稿；2015-05-17修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.012

*本文通信作者，Email: richardwangxp@163.com