真核细胞自噬现象及其对骨重塑的作用

刘 勃，尹鹏滨，张立海，陈思斌，全宸良，王 松 综述 唐佩福 审校



真核细胞自噬现象及其对骨重塑的作用

刘 勃，尹鹏滨，张立海，陈思斌，全宸良，王 松 综述 唐佩福 审校

自噬；骨重塑；骨稳态；骨代谢疾病

众所周知，骨骼为躯体提供支撑和保护，骨功能的发挥需要骨形态、骨量、骨质等的长期稳定。骨骼是个不断变化的器官，在整个生命周期中，一直存在骨吸收和骨生成活动。机体通过骨重塑过程达到或维持骨稳态。在成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等细胞、激素、相关理化因子的密切配合下，其过程受到精密调控。骨重塑过程障碍会导致骨硬化症、骨质疏松症、佩吉特骨病等多种骨病。越来越多的研究表明，自噬参与调控成、破骨及骨细胞生命活动。自噬很可能参与骨重塑过程。笔者将对自噬参与骨重塑过程的研究进展进行综述。

1 真核细胞自噬现象

自噬是真核细胞生物主要的降解系统之一，细胞通过自噬将胞内异常蛋白质、受损和老化的细胞器、病原体等降解，产生氨基酸、核苷酸等供机体进行物质合成、能量代谢等生命活动。自噬具有重要意义：一方面，细胞长期维持低水平的自噬活动，清除生命活动中产生的各种“不良”物质，维持胞内环境的相对稳定；另一方面发生营养匮乏、缺氧、炎性反应、感染等应激状况时，胞内自噬活动增强，产生更多氨基酸、核苷酸等，细胞藉此对抗应激、维持存活[1]。自噬分为启动、成核、延伸、融合降解四个阶段，每个阶段都受到相关蛋白的精密调控。自噬启动时，ULK1脱磷酸，ULK1-ATG13-ATG101-FIP200复合体活化，激活Ambra1，Beclin-1-Vsp34-Vsp15-ATG14L-Ambra1复合体在成核部位聚集并活化，Ambra1与TRAF6还可活化ULK1-ATG13-ATG101-FIP200复合体，活化的Beclin-1-Vsp34-Vsp15-ATG14L-Ambra1复合体产生PI3P，PI3P募集DFCP1、WIPI等蛋白促进成核(nucleation)；成核部位出现游离双层膜结构；ATG7、ATG10作用下，ATG12-ATG5-ATG16L复合物形成，ATG7、ATG3作用下，水溶性LC-I结合PE变为脂溶性的LC-II；两者(ATG12-ATG5-ATG16L复合物和LC-II)均结合在新生成的双层膜结构上，共同促使双层膜结构不断延伸，包裹部分胞浆及待分解的底物，形成自噬体；随后自噬体外膜与溶酶体融合，内膜及包裹的底物释放到溶酶体腔中被降解并循环利用，包括p62、NBR1、NDP52等多种支架蛋白参与此过程[2]。

2 自噬对骨重塑的作用

骨重塑是一个受到精密调控的过程，多种细胞、大量细胞因子及相关生化因子参与其中。细胞方面，来源于造血干细胞的破骨细胞进行骨吸收。随后来源于间充质干细胞的成骨细胞合成骨基质，并参与其矿化，生成新骨。成骨细胞包埋在矿化的骨基质中变为终末分化的骨细胞，骨细胞感受骨内的应力及激素水平变化，调控成、破骨细胞活动。大量研究表明，自噬相关蛋白参与调控成骨细胞、破骨细胞及骨细胞的生命活动；全基因组关联研究发现，自噬相关基因与身高及骨质疏松症密切相关。种种迹象表明自噬参与骨重塑及相关疾病的调控过程。

2.1 成骨细胞与自噬 成骨细胞调节骨形成，骨形成受到精密调控。诸如PTH、TGFβ-1、IGF、BMP等大量激素和细胞因子参与其调控[3]。有研究表明，BMP具有强烈成骨作用，它的拮抗剂NOG可以使急性胰腺炎细胞中LC-II降低，而加入过量BMP2后，这种效应被逆转，且BECN1、LAMP2水平会升高[4]。间接说明成骨活动可能受到自噬调节。自噬受体NBR1是一种重要的支架蛋白，它一方面通过LIR结构域与自噬体膜上的LC-II结合，另一方面通过UBA结构域与底物结合，从而使底物结合到自噬体中。Whitehouse等[5]采用基因修饰的方法使NBR1的LIR和UBA结构域缺失，构建了Nbr1tr/tr小鼠模型。Nbr1tr/tr小鼠体内自噬水平低，出生9个月时骨量、骨矿物质密度与对照组相比显著增加。细胞学研究表明，Nbr1tr/tr小鼠成骨细胞MAPK信号通路激活，细胞分化及成骨能力显著增强[5]。然而有人得出不同结论，Liu等[6]靶向敲除了成骨细胞中诱导自噬发生的ULK1-ATG13-ATG101-FIP200复合体的重要构成物FIP200，构建了FIP200F/F小鼠模型；出生6个月后小鼠体内自噬水平低，骨质及骨量较对照组明显降低，进一步研究发现FIP200F/F小鼠成骨细胞的晚期分化能力以及矿化新合成的骨基质的能力降低。与此相一致，Darcy等[7]发现自噬诱导剂雷帕霉素促进成骨细胞分化。Nollet等[8]发现敲除ATG7、BECN1的成骨细胞矿化新合成的骨基质的能力降低，并指出自噬体可能是成骨细胞分泌羟基磷灰石的载体。总的看来，自噬是促进还是抑制成骨细胞分化、增殖及矿化成骨仍是一个悬而未决的问题，且涉及的分子机制还需要进行深入研究。

2.2 破骨细胞与自噬 破骨细胞介导骨吸收。来源于造血干细胞的破骨前体细胞，受M-CSF、RANKL刺激后，分化为破骨细胞。破骨细胞吸收骨基质中的有机物和无机物，致使骨基质表面凹凸不平，形成细胞样的骨陷窝。破骨细胞面向骨陷窝的一侧，伸出许多绒毛样的凸起，构成刷状缘。破骨细胞通过刷状缘分泌酸及CTSK、MMP9、MMP13等水解酶来分解骨质[3]。自噬可抑制破骨细胞增殖、分化及功能活化。DeSelm等[9]发现，敲除破骨细胞前体的ATG5、ATG7，破骨细胞刷状缘形成障碍，水解酶分泌减少，骨吸收能力下降；而分化情况未受影响。免疫抑制药雷帕霉素通过阻断mTOR信号通路促进自噬。Sanchez等[10]发现给幼年大鼠饲喂雷帕霉素后其胫骨骨骺处破骨细胞数目减少，自噬水平降低。Smink等[11]发现，雷帕霉素可通过C/EBPβ-MafB信号通路抑制自噬同时减少破骨细胞生成。但也有研究者认为，自噬促进破骨细胞骨吸收活动。ZHAO等[12]使用自噬抑制药3-MA处理缺氧环境下培养的类破骨细胞RAW264.7，发现其增殖分化能力明显降低，进一步的研究发现细胞通过HIF-1a/BNIP3信号通路调控自噬及破骨细胞生成分化。越来越多研究表明，自噬参与破骨细胞增殖、分化及功能活化，细胞自噬活动异常可能导致某些骨疾病的发生。通过前期研究人们对破骨细胞自噬活动有了一定了解，但是对参与调控的相关分子通路仍然缺乏足够了解，有待进一步地研究。

2.3 骨细胞与自噬 骨细胞在骨重塑过程中发挥重要作用：一方面它合成骨硬化蛋白，通过Wnt信号通路抑制成骨细胞成骨[13]；另一方面合成RANKL，通过RANKL/RANK/OPG轴促进破骨细胞破骨[14]。研究表明，骨细胞帮助破骨细胞识别骨重塑的发生部位，其凋亡崩解后释放含有RANKL的凋亡小体，促进破骨[15]。骨细胞是终末分化的成骨细胞，成骨细胞包埋在新合成的骨基质中，伸出突起与周围细胞形成缝隙连接，分化为骨细胞。骨组织内缺氧且营养相对匮乏，骨细胞在其中长期生存，存在较高自噬水平。Zahm等[16]发现小鼠长骨来源的骨样细胞MLO-A5细胞系在营养匮乏、缺氧等应激条件下自噬水平升高，进而推测自噬是骨细胞在骨组织应激条件下得以长期生存的原因。Onal等[17]发现，靶向敲除骨细胞Atg7，小鼠自噬水平降低，皮质骨变薄，骨量明显下降，与衰老时骨骼的表现一致，因此，可以推测动物衰老后骨量减低与骨细胞的较低自噬水平有关。Luo等[15]定期向衰老大鼠腹腔注射自噬诱导剂雷帕霉素，3个月后大鼠骨细胞自噬水平升高，骨量下降速度减缓。目前关于骨细胞自噬的研究相对较少，现有的证据表明自噬可能延长骨细胞存活时间，防止骨流失。关于自噬如何调控骨细胞功能发挥还有待进一步阐明。

2.4 骨疾病与自噬 骨质疏松症是一种以骨量减低、骨显微结构破坏、骨脆性增加、易发生骨折为特点的代谢性骨病。好发于老年人及绝经后妇女，它起病隐匿，患者往往在发生骨折或是体检时才发现患病。致死、致残率高，给患者及其家庭带来巨大的身心痛苦和沉重的经济负担。骨重塑异常被认为是骨质疏松症的可能病因[18]。目前，人们对调控骨重塑的分子通路仍然缺乏足够认识。通过研究各种骨细胞的自噬现象及相关分子机制，有助于深入了解骨质疏松症的病因并找到对应的药物靶点。骨折是骨的完整性和连续性遭到破坏。骨折后，骨及周围组织细胞的稳态被打破，机体发生一系列生理和病理反应来恢复骨折前的平衡状态。以往的研究表明，对抗应激、维持细胞内环境的稳定是自噬的基本作用。那么，骨折后机体的自噬水平是否发生变化？能否通过调控自噬来影响骨折恢复进程呢？对于这些问题一些研究小组已经进行了初步的探索。Zhou等[19]发现骨折局部细胞增殖水平和自噬水平正相关。Ge等[20]发现，通过腹腔给予骨折大鼠自噬诱导剂雷帕霉素可以使其自噬水平提高、骨痂形成量增多、骨折愈合加速。然而，雷帕霉素不良反应较大，找到伤害小、疗效好的自噬调节剂是未来研究的一个方向。

虽然前期研究取得部分进展，但还有许多问题亟待解决。如，是自噬相关蛋白还是自噬过程本身参与调控骨重塑过程？自噬通过哪些分子通路调控各类骨细胞的增殖、分化及功能活化？自噬过程如何影响各类骨细胞的生存和死亡？研究自噬活动与骨重塑的关系意义重大：一方面可以加深对诸如骨质疏松症等代谢性骨病病因及骨折愈合过程的了解，发现代谢性骨病的新治疗靶点以及加速骨折愈合的方法；另一方面可以探索新的实验技术，拓展原有技术的应用范围。相信随着研究技术的进步和相关知识的积累，在这方面的研究会取得越来越多的成果。

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(2016-04-05收稿 2016-07-15修回)

(责任编辑 张 楠)

刘 勃，硕士研究生。

100853 北京，解放军总医院骨科

张立海，E-mail:zhanglihai74@qq.com

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