光动力疗法的抗肿瘤机制及光敏剂的研究进展

史澍睿 王悦 万国运 王银松 张连云 张娟

300070天津医科大学附属口腔医院口腔修复科（史澍睿、王悦、张连云、张娟）；300070天津医科大学药学院（万国运、王银松）

光动力疗法的抗肿瘤机制及光敏剂的研究进展

史澍睿 王悦 万国运 王银松 张连云 张娟

300070天津医科大学附属口腔医院口腔修复科（史澍睿、王悦、张连云、张娟）；300070天津医科大学药学院（万国运、王银松）

光动力疗法（PDT）是利用光动力效应对疾病进行诊断与治疗的一种非侵袭性技术，已被用于临床头颈部、乳腺、肺、前列腺及皮肤等部位肿瘤的治疗。与传统治疗方法相比，PDT具有创伤小、毒性低、选择性好、适用范围广及不易产生耐药等优势，因而受到肿瘤治疗领域的广泛关注。PDT的抗肿瘤机制复杂，光敏剂是发挥其光动力学效应的关键因素之一，提高光敏剂的靶向输送和携氧能力是改善光动力疗效的重要途径。对PDT的抗肿瘤机制及光敏剂的研究进展进行综述。

光动力疗法； 光敏剂； 作用机制

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81572655,81573005)

0 引 言

目前，临床中恶性肿瘤的治疗方法包括手术切除、放射治疗（放疗）和化学药物治疗（化疗）。手术切除往往会造成组织结构和功能的损伤，有淋巴转移时不易彻底切除，并且容易复发；化疗对肿瘤组织的选择性较差，毒性大，易产生耐药；放疗受限于累计辐射剂量以及骨质的吸收，副作用较大，对不敏感的肿瘤难以提高剂量。近年来，免疫疗法在肿瘤治疗领域备受关注，但其仍是当前肿瘤综合治疗的辅助手段，不能完全取代传统的治疗方法[1]。因此，探寻低毒有效的肿瘤治疗方法成为临床肿瘤治疗的关键性问题。

光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术。PDT的治疗基础是一种有氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应，即特定波长的激光照射使组织吸收的光敏剂受到激发，产生能量并传递给周围的氧，生成活性氧（reactive oxygen species，ROS），继而与相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，诱导细胞凋亡乃至死亡。研究结果表明，PDT的作用机制复杂，可抑制肿瘤脉管系统的生成，激活宿主的抗肿瘤免疫反应[2-6]，从而有望实现对肿瘤的彻底治愈和长期控制。与传统肿瘤治疗方法相比，PDT具有创伤小、毒性低、选择性好、适用性强及不易产生耐药等优势，因而在肿瘤的治疗中被寄予极大希望。光敏剂是发挥PDT光动力学效应的关键因素之一，提高光敏剂的靶向输送和携氧能力被认为是改善光动力疗效的重要途径。本文从PDT的抗肿瘤机制与光敏剂的研究进展等方面进行综述。

1 光动力反应的基本原理

PDT的治疗过程中，光敏剂吸收光能由基态变成短暂存在的单重激发态，被激发的光敏剂可通过自发辐射荧光返回至基态，或经历系间跃迁，通过受激电子的自旋反转形成一个相对稳定的三重态。三重激发态光敏剂可与细胞膜或分子等基质结合，转移氢离子或者电子形成氧自由基，并与氧反应生成各种过氧化物、超氧化物（Ⅰ型反应）；此外，三重激发态光敏剂还可将能量直接转移至氧分子，从而产生具有较强细胞毒性的ROS（Ⅱ型反应）[7-9]。由此可见，只有光敏剂、光与氧3种因素的共同参与，才能产生具有治疗作用的ROS，发挥PDT的疗效。

2 PDT的抗肿瘤机制

PDT的抗肿瘤作用取决于多种因素，如光敏剂的种类及其肿瘤微环境中的蓄积浓度和定位、光照条件、肿瘤类型以及组织氧的浓度等。光动力反应所产生的ROS是引起肿瘤组织不可逆损伤的关键因素，这些损伤主要针对肿瘤细胞、肿瘤脉管系统以及抗肿瘤免疫和炎症反应的激活，从而实现对肿瘤长期有效的控制。

2.1 PDT对肿瘤细胞的直接杀伤作用

通常，光损伤部位与光敏剂在肿瘤细胞中的定位是一致的。光敏剂在光照激发下发生光动力反应，产生的活性氧可造成脂质、氨基酸和蛋白质的氧化，继而引起诸如细胞膜、线粒体、溶酶体等重要亚细胞结构不可逆的损伤，最终导致肿瘤细胞的凋亡或死亡。光敏剂的亚细胞定位决定了PDT的作用效果，研究结果表明，不同类型的光敏剂可能会造成不同亚细胞器的损伤[10-11]。

Gayathri等用3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基方酸作为光敏剂，介导PDT治疗小鼠皮肤癌，发现方酸染料定位于线粒体，经光照激发产生的ROS可引起线粒体膜损伤，细胞色素c的大量释放，并且细胞凋亡标记物caspase-3与bax的表达显著增加，而与细胞损伤程度呈负相关的bcl-2表达降低。研究数据表明PDT线粒体凋亡通路的被激活[12]。鉴于肿瘤细胞溶酶体的低pH环境（4.5～5.0），Tian等[13]制备了包载pH激活型卟啉光敏剂（NMe2Se4N2），表面叶酸功能化的聚合物纳米粒。该纳米粒可特异性地识别肿瘤细胞表面的叶酸受体，通过受体介导的胞吞途径入胞，继而定位于溶酶体。溶酶体内部低pH环境激活NMe2Se4N2，在光照下产生ROS，导致溶酶体膜的损坏，诱导肿瘤细胞以溶酶体途径凋亡。有研究表明，经过洋地黄皂甙处理过的溶酶体可以在体外激活caspase前体并引发细胞凋亡[14]，纯化后的溶酶体蛋白酶-组织蛋白酶B是激活caspase前体的关键因素[15]。亦有研究者认为，溶酶体损伤介导的细胞凋亡机制为溶酶体蛋白酶引起线粒体膜的破坏，再通过细胞色素c的释放激活caspase前体来间接引发细胞凋亡[16-17]。Kessel等[18]应用优先定位于溶酶体的光敏剂NPe6、LCP、LuTex来对肿瘤细胞进行PDT治疗，用以研究溶酶体蛋白酶为使动因素诱导细胞凋亡的作用机制。结果证实，溶酶体损伤可造成组织蛋白酶B的释放、线粒体膜的破坏、细胞色素c的释放以及DEVDase的激活，从而间接介导了细胞的凋亡。关于PDT引起细胞膜损伤而造成的细胞凋亡也有相关研究报道。Mitsunaga等[19]将可被波长为700 nm的近红外可见光激发的光敏剂IR700与曲妥单抗和帕尼单抗偶联，构建靶向细胞膜的光敏剂。由于曲妥单抗和帕尼单抗能够与A431及HER2基因转染的NIH3T3细胞膜表面的表皮生长因子受体HER1和HER2特异性结合，因此可介导光敏剂定位于细胞膜。在近红外光的照射下，光敏剂发生光动力反应，产生大量ROS破坏细胞膜，诱导细胞凋亡；并且小鼠体内实验结果显示，肿瘤的生长得到了有效抑制，生存期显著延长。

2.2 PDT对肿瘤组织脉管系统的损伤作用

实体肿瘤的生长、浸润与转移依赖于肿瘤血管的生成。新生血管为肿瘤细胞的迅速无限生长提供所需的氧气和营养，并运走代谢废物。然而，因肿瘤新生血管具有结构异常、排列紊乱、基底膜不完整、缺少细胞间的紧密连接及通透性较高的特点，为光敏剂在肿瘤组织中的蓄积提供了可能。此外，光敏剂与血液循环中的特异性受体结合后，由于产生对微血管内皮细胞很强的亲和力而定位于肿瘤新生血管；光照激活光敏剂的光动力反应，产生的ROS可造成细胞间紧密连接的裂解以及血管基膜的暴漏，从而破坏肿瘤血管内皮细胞。这些发生于血管腔中的变化可引发血栓形成、血小板凝集、血管活性因子的释放、白细胞黏附、血管渗透性增加以及血管重建等一系列级联反应，继而引发部分或完整的血管闭塞、血流瘀滞和组织出血，最终造成肿瘤组织内部的缺氧。PDT对脉管系统的损伤作用是其抗肿瘤的重要机制之一。

Dolmans等[20]利用靶向血管的光敏剂MV6401来研究PDT对肿瘤血管损伤的机制。通过小鼠尾静脉注射给药，15 min内光敏剂只分布于血管而不向肿瘤组织内部扩散；给予光照后，肿瘤组织表现出光敏剂剂量依赖性的血液瘀滞、缺血、肿瘤内部出血、血管消失以及血栓形成等反应，最终肿瘤组织因缺血、缺氧其生长受到抑制。Gallagher-Colombo等[21]用基于苯并卟啉的光敏剂BPD结合厄洛替尼/贝格单抗介导PDT治疗非小细胞肺癌，也发现了较好的肿瘤血管关闭效应。由此可见，光敏剂在血管中的蓄积是发挥PDT对脉管系统损伤作用的前提，其损伤的程度取决于光敏剂在血管中的富集量[22]。在Peng和Nesland[23]关于肿瘤微环境对PDT疗效影响研究的基础上，Maas等[24]提出血管中的胶原含量越多则越利于光敏剂的富集。其在肿瘤移植的同时植入了人工血管基底膜来模拟胶原含量增多的血管环境，并证实相比于未经处理的肿瘤组织卟啉更易富集于这种有基底膜补充的血管，从而表现出更强的淤血、血栓形成、血流灌注量下降等一系列血管破坏作用。因此，血管基底膜在PDT疗效中扮演着重要的作用，相关的研究为肿瘤治疗中PDT的应用提供了新的思路。

2.3 PDT对抗肿瘤免疫和炎症反应的激活

传统的肿瘤治疗方法均具有或多或少的免疫抑制效应，足够剂量的化疗药物和电离辐射杀伤肿瘤组织的同时对骨髓也会产生较大毒性，外科手术同样有大大减弱淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞功能的免疫抑制效应。理想的肿瘤治疗效果应该是不仅可消灭原发性肿瘤，还可激活机体免疫系统去识别、追踪、杀伤残留的原发灶或远处转移的肿瘤，从而实现对肿瘤的彻底治愈和长期控制。已有很多研究显示，PDT能够打乱肿瘤内部的免疫稳态，激活相应的免疫反应和炎症反应，产生抗肿瘤作用。

Zheng等[25]在用金丝桃素介导PDT治疗小鼠Lewis肺癌的研究中发现，肿瘤细胞受损后释放出大量的损伤相关蛋白（如HSP70、HSP90、CRT等）向机体的免疫系统递送一系列信号，使“不要吃我”的免疫抑制信号CD47的表达减弱，同时诱发树突状细胞的成熟、活化以及加强对抗原的加工，成熟树突状细胞表达的协同刺激分子CD86、CD80、CD40可激活CD8+T淋巴细胞，继而介导机体的抗肿瘤免疫反应。Bai等将抗癌药物顺铂的配位聚合物与连接磷脂的卟啉分子共载于纳米体系内，以联合化疗与PDT来治疗肿瘤。小鼠体内实验结果显示，该纳米体系可通过实体瘤的高通透性和滞留（enhanced permeability and retention effect，EPR）效应靶向递送顺铂与卟啉至肿瘤病灶，光照激活后显示出显著强于顺铂和卟啉的细胞毒性，同时ELISA实验结果显示，小鼠血液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子释放明显升高，说明PDT激活了以急性炎症为首的非特异性免疫反应[26]。由此推测，PDT可激活机体相应的免疫反应和炎症反应，促进淋巴细胞呈递及其对肿瘤细胞的识别与吞噬，并通过调节细胞因子的释放来加剧炎症反应，从而实现对肿瘤的彻底治愈和长期控制。

3 光敏剂的发展及修饰

与传统的肿瘤治疗手段相比，PDT显示出创伤小、选择性好等优势，但临床应用仍存在以下不足：①作用表浅。由于光敏剂本身对皮肤、组织的渗透能力较差，并且光敏剂的激发波长大多数＜700 nm，对皮肤、组织的穿透深度仅有几个毫米，因此PDT对深部肿瘤的治疗效果并不佳。②稳定性差。大多数的光敏剂疏水性较强，在血液循环中容易被血清蛋白吸附，进而较快被单核细胞吞噬或被网状内皮系统的巨噬细胞清除，因此体内稳定性差。少数亲水性的光敏剂也不稳定，容易被酶催化降解。③光敏剂的肿瘤选择性有限，静脉注射给药时还可能发生皮肤光毒性损伤[27]。理想的光敏剂应是对肿瘤组织具有高选择性，可以忽略不计的光毒性以及高量子产率的ROS，更为重要的是开发能被近红外可见光激发的光敏剂，实现对深部肿瘤的治疗。因此，作为PDT治疗的关键因素，如何提高光敏剂的疗效是目前光动力肿瘤治疗领域的热点和难点。

第一代光敏剂是血卟啉及其衍生物，在二十世纪七八十年代得以发展。尽管第一代光敏剂光毒性小，且易制成水溶性制剂，便于静脉输送，但其对组织渗透作用最佳的近红外可见光吸收相对较弱，穿透性大大降低，对深部肿瘤的疗效不佳。此外，其在正常组织和皮肤中的累积时间长，造成PDT治疗后严重的光毒性。第二代光敏剂包括5-氨基酮戊酸、间-四羟基苯基二氢卟酚、初卟啉锡、亚甲基兰和亚甲苯兰、苯卟啉衍生物以及luteliumtexaphyrins、苯并卟啉衍生物单酸、酞青类、得克萨卟啉、N-天门冬酰基二氢卟酚、金丝桃素、血卟啉单甲醚等。第二代光敏剂能够部分克服第一代光敏剂的缺点，更加符合理想光敏剂的特点。其表现为光敏期短、作用的光波波长较长、组织穿透性强、ROS也较多，对肿瘤病灶具有更高的选择性[28-29]。第三代光敏剂被寄希望于拥有更好的肿瘤治疗特性，如更佳的生物相容性、更强的肿瘤靶向性以及更高的ROS产率等。这些特性可通过纳米载体对光敏剂的包载，以及多肽或抗体对光敏剂的靶向修饰来实现。此外，由于肿瘤组织具有异于正常组织的特殊血管和淋巴结构，纳米尺寸的颗粒较易通过EPR效应进入肿瘤深部[30-32]，并且纳米载体能够同时携载多种治疗剂，从而实现多种功能的整合。由此可见，纳米载体的应用在提高光敏剂的稳定性、肿瘤靶向性，以及实现PDT与其他治疗方法的联合等方面显示出巨大优势，因而备受关注。

3.1 生物降解性合成高分子纳米载体

以生物降解性聚酯类高分子为材料制备的纳米粒与纳米胶束，能有效包载各种亲疏水性、相对分子质量及电荷的光敏剂，并通过肿瘤靶向转运与缓控释作用提高光敏剂的光敏活性，降低其毒性。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（latic-co-glycolic acid），PLGA）作为第一批可降解材料被美国FDA批准用于临床，是迄今研究最为广泛、应用最多的聚酯类高分子材料。Fadel等[33]将光敏剂锌酞菁包载于PLGA纳米粒中发现，其相比于游离光敏剂具有更好的肿瘤靶向性、更高的入胞率及更强的体内外光动力疗效。Konan等[34]以PLGA为材料制备了粒径约为130 nm，包载光敏剂5，10，15，20-四甲苯基卟啉（p-THPP）的载药纳米粒。后续在对乳腺癌EMT-6细胞的毒性考察中，发现载药纳米粒在更短的孵育时间和约50%的药物剂量下即可达到与游离p-THPP相当的细胞毒性。此外，Delie小组用PLGA纳米粒包载光敏剂金丝桃素，并在卵巢癌NuTu-19细胞中也得到了相似的治疗效果[35]。

3.2 天然来源的生物降解性高分子纳米载体

天然来源的生物可降解材料主要包括蛋白、多糖和抗体等。单克隆抗体由于可以识别肿瘤细胞表面的特异性受体如表皮生长因子受体等，因此单克隆抗体的修饰可以增强光敏剂对肿瘤的主动靶向性。Malatesti等[36]将光敏剂与靶向肿瘤细胞的单克隆抗体结合，使之对肿瘤细胞表面的抗原具有特异亲和性，从而实现了光敏剂的肿瘤靶向递送。肿瘤细胞表面过表达低密度脂蛋白受体，因此可以通过低密度脂蛋白的修饰提高光敏剂的肿瘤靶向性，特别适用于对疏水性光敏剂的修饰[37]。研究结果表明，白蛋白纳米粒能够携载抗肿瘤、抗结核、降血糖、抗菌素、激素、支气管扩张剂等100多种药物，并可通过静脉注射、肌肉注射、关节腔内注射、口服、呼吸系统等多途径给药[38]。Wacker等[39]将光敏剂5,10, 15，20-四间羟基苯基二氢卟啉（m-THPP）载于白蛋白纳米粒，发现其与游离m-THPP光敏剂相比，有着对急性T细胞白血病Jurkat细胞更强的光毒性及更低的暗毒性。Deda等[40]将5，10，15-三苯基-20-（3-N-甲基吡啶鎓基）卟啉包封于黄原胶纳米粒，Hela细胞的光毒性与其卵磷脂乳剂相比，高出近4倍。Lee等[41]将原卟啉IX偶联于乙二醇壳聚糖，制备了具有“核-壳”结构的纳米粒（PpIX-GC），用于对肿瘤的光动力成像与治疗。研究结果表明，PpIX-GC纳米粒能够被肿瘤细胞有效摄取，并在光照激发下解体，产生较强的荧光信号及大量的ROS，从而实现荧光成像以及对肿瘤细胞的高效杀伤；并且PpIX-GC纳米粒显著延长了PpIX在荷瘤小鼠体内的血液循环时间，增加了PpIX在肿瘤组织中的蓄积，从而大大提高了PpIX对肿瘤的光动力疗效。

3.3 脂质体

脂质体（liposome）是利用磷脂双分子层膜组成的内部为水相的单层或多层封闭囊泡。脂质体的结构类似生物膜，又称人工生物膜，尺寸在几十纳米到几十微米之间，每层膜的厚度约为4 nm，具有良好的生物相容性。脂质体的内水相和磷脂双分子层膜可用于包载水溶性或疏水性的多种物质。用脂质体包载光敏剂可改善其水溶性，提高生物相容性。Basoglu等[42]用磁性脂质体包载疏水的原卟啉IX制备纳米载药体系，可显著改善原卟啉IX水溶性，提高其生物相容性和肿瘤靶向性，对乳腺癌MCF-7细胞表现出更强的光动力疗效。由于传统的脂质体稳定性差，载药量低，药物容易泄漏，从而使疗效降低，导致较为严重的光毒性；并且传统脂质体对肝脾以外的组织或器官的靶向性差，载送光敏剂时不能提高肿瘤/正常组织的药物浓度比，因而难以广泛用于抗肿瘤的PDT治疗。对脂质体进行改良和修饰，制备长循环和靶向脂质体，即可延长脂质体的血液循环时间，实现对肿瘤病灶的主动靶向作用，因而更适宜作光敏剂的载体。目前临床使用的长循环脂质体是经过聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）表面修饰，以增加脂质体外壳的柔顺性和亲水性，减少磷脂膜与血浆蛋白的相互作用，从而避免单核-巨噬细胞的吞噬，延长循环时间[43]。若将抗体或配基化学键合于PEG末端，则既可保持脂质体长循环的特性，又可实现对靶标的主动识别，达到高效转运光敏剂的目的[44]。

3.4 提高ROS产率的修饰

PDT对肿瘤作用的机制之一是将肿瘤内部的氧转化为ROS来杀伤肿瘤细胞。然而实体瘤瘤体与血管之间的发育不协调，相当部分的肿瘤细胞处于缺氧状态，加之PDT本身就是一个耗氧的过程，导致产生ROS的底物不足，从而影响PDT的抗肿瘤疗效。最近，Cheng等[45]合成了一种载光敏剂IR780与全氟化碳的纳米载药系统。相比于水相，氧在全氟化碳中具有更高的溶解度，并且PDT产生的单线态氧在全氟化碳相中具有更长的寿命。因此，该纳米载体系统可以实现光敏剂与氧的共载，为高效发挥PDT的抗肿瘤作用提供了保障。体内外实验数据显示，纳米载药体系可通过EPR效应靶向转运IR780至肿瘤病灶，血运过程中溶解于全氟化碳的氧逐渐释放，为光敏剂产生ROS提供了充足的底物，因此表现出显著增强的PDT抗肿瘤疗效[42]。

4 结 语

综上所述，作为一种非侵袭性治疗方法，PDT可通过直接杀伤肿瘤细胞、破坏肿瘤脉管系统以及激活机体抗肿瘤免疫等多种机制，实现对肿瘤的高效治疗，因此越来越受到肿瘤治疗领域的广泛关注。光敏剂、光与氧是发挥PDT疗效的3大因素。其中如何改善光敏剂的体内稳定性与肿瘤靶向性，提高其光动力效应并降低光毒性是当前PDT抗肿瘤研究的热点和难点，研究表明，通过对光敏剂的靶向修饰或纳米载体的携载有望解决这些难题。此外，开发能够被近红外可见光激发的光敏剂以及通过携氧增强PDT的抗肿瘤作用，从而实现对深部肿瘤的治疗，提高ROS的产率杀伤肿瘤，成为近年来PDT研究的新方向。

利益冲突 无

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Research advances in action mechanisms of photodynamic therapy and photosensitizer

Shi Shurui,Wang Yue,Wan Guoyun,Wang Yinsong,Zhang Lianyun,Zhang Juan

Department of Prosthodontics,Stomatological Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China(Shi SR, Wang Y,Zhang LY,Zhang J);School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China(Wan GY, Wang YS)

Zhang Juan,Email:kqzhangjuan@126.com;Wang Yinsong,Email:wangyinsong@tmu.edu.cn

Photodynamic therapy(PDT)is a noninvasive technique for diagnosis and therapy of diseases by using the photodynamic effects.Clinically,PDT has been used in the treatments of various tumors in head and neck, pancreas,lung,prostate and skin.Compared to the traditional treatments of tumors,PDT exhibits many advantages such as less damage,low toxicity,good selectivity,wide applicability and less drug resistance,which draw more attention in the field of tumor therapy.The action mechanisms of PDT against tumors are very complicated and photosensitizer is one of the key factors that influence the photodynamic effects of PDT.To enhance the tumortargeted delivery of photosensitizer and improve their oxygen-carrying ability are believed as the important ways to increase the photodynamic effects.In this paper,review is given on the research advances in action mechanisms of photodynamic therapy and photosensitizer in recent years.

Photodynamic therapy; Photosensitizer; Action mechanism

张娟，Email:kqzhangjuan@126.com；王银松，Email:wangyinsong@tmu.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．05．010

国家自然科学基金（81572655，81573005）

2016-08-03）