650 nm低能量激光照射离体高血脂全血和红细胞对其吸收光谱的影响

王海臣 王宏 刘伟超 吕菊保 沙洪

300192天津，中国医学科学院 北京协和医学院生物医学工程研究所

650 nm低能量激光照射离体高血脂全血和红细胞对其吸收光谱的影响

王海臣 王宏 刘伟超 吕菊保 沙洪

300192天津，中国医学科学院 北京协和医学院生物医学工程研究所

目的 研究低能量激光照射离体高血脂全血和红细胞对其吸收光谱的影响。方法 选取30例高血脂患者血样为高血脂组，30例正常血样为正常组，用多功能酶标仪分别对血样的全血和红细胞进行扫描，比较两个样本吸收光谱的异同；选用低能量650 nm激光照射待测血样，用多功能酶标仪对全血和红细胞进行扫描并比较照射前后吸收光谱的变化。结果 高血脂血样的全血和红细胞在416、544、578 nm处的吸收峰值均比正常血样高，因此，可通过光谱吸收峰初步判定血液中血脂异常的情况。650 nm激光照射30例高血脂血样后，红细胞在416、544、578 nm处峰值分别降低，照射前后差异具有统计学意义（P＜0.05）；全血照射后其吸收光谱在416、544、578 nm升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 650 nm低能量激光照射可降低高血脂红细胞对光谱的吸收峰，且有助于改善红细胞膜-浆脂质的平衡，从光谱学角度证明了激光治疗高血脂疾病的可行性。

低能量激光； 高血脂； 吸收光谱； 多功能酶标仪

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81602800,81301288)

0 引 言

高血脂又称血脂紊乱或血脂异常，是指人体内血清（血浆）脂质浓度超出了正常范围[1]。高血脂症是一类较常见的疾病，除少数是由于全身性疾病所致外，绝大多数是因遗传基因缺陷或与环境因素相互作用引起的。高血脂是诱发动脉血管粥样硬化以及心脑血管等多种疾病的重要因素，因此改善体内血脂水平是治疗高血脂的关键环节[2-3]。对于血脂的治疗，临床上有各种疗法，如抽脂手术[4]、针灸治疗[5]、药物治疗、激光治疗[6]等。其中激光治疗效果显著，目前未发现副作用。自20世纪90年代以来，低能量激光照射疗法（low-level laser therapy，LLLT）引入我国，此疗法是利用激光的生物学效应调整机体的免疫系统、血液循环系统和组织代谢系统等，使病例状态恢复正常的一种疗法[7]。低能量激光照射在以下方面效果显著：①改善红细胞变形能力和红细胞刚性。②提高红细胞载氧能力，加速血氧结合[8]。③纠正微循环，调节免疫系统，增强免疫能力[9]。④提高组织修复能力[10-11]。国际上以临床研究为依据，各种治疗高血脂手段的研究层出不穷，虽然多数研究结果证明激光治疗是治疗高血脂症的可行性手段，但其详细作用机理的研究并不充分[12-13]。本研究旨在利用低能量激光照射对生物组织作用产生生物效应，激光照射离体血液后，观察全血及红细胞对光谱吸收的变化来分析血脂的改变，从而为低能量激光照射改善高血脂人群的血脂水平提供新的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取天津医科大学眼科医院检验科正常血样30例（胆固醇浓度＜5.72 mmol/L、甘油三酯浓度＜1.70 mmol/L）；高血脂血样30例（胆固醇浓度＞5.72 mmol/L和/或甘油三酯浓度＞1.70 mmol/L）。60例样本中女性23例，年龄为25～78岁，平均年龄为（68.5±13.5）岁，采用肝素抗凝。将性别、年龄、血细胞计数、白细胞计数以及血小板经统计学处理，差异均无统计学意义（P＞0.05），胆固醇、甘油三酯含量差异具有统计学意义（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与仪器

0.9%生理盐水（浙江齐敏制药），肝素（上海源叶生物科技有限公司）。全波长多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），日立7100全自动生化分析仪（日本Hitachi公司），Pentra全自动血液分析仪（法国ABX公司），HES-TBD550红细胞分离液（上海通善生物科技有限公司），KA-1000型台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造），650 nm双波长半导体激光器（中国医学科学院生物医学工程研究所激光医学实验室研制）。

1.2.2 血样的选取

选取医院中用全自动生化分析仪测出的30例高血脂血样和30例血脂正常血样各4 ml，其中高血脂含量标准符合卫生部颁发的《中药新药治疗高血脂的临床研究指导原则》。用全自动血液分析仪主要检测血样的红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量、红细胞压积等。采用肝素（1 000 U/ml）抗凝，并将血样保存于（4±2）℃，作为实验待测液。

1.2.3 低能量激光照射

将正常血样设为正常组，高血脂血样设为高血脂组。高血脂组与正常组分别用波长为650 nm激光照射，调整激光参数，使激光器输出功率密度为20 mW/cm2，激光能量密度为12 J/cm2。将血样轻轻混匀，吸取1 ml至干净的24孔板中，标记对应的血样编号；将激光器和光纤连接好，并调整好激光照射位置，使激光最亮的光斑对准孔板的正中间位置，关闭日光灯；将24孔板放在照射台上，每孔照射15 min，每5分钟摇动孔板一次，以保证血样照射均匀；然后吸取照射后的血样0.5 ml进行红细胞分离，分离的红细胞与剩下的0.5 ml全血样本稀释之后用酶标仪进行光谱扫描。

1.2.4 红细胞的分离和提取

将待测分离血样按体积比1∶1与生理盐水混合稀释；然后再按体积比1∶1加入细胞分离液，置于塑料离心管中，1 500 r/min离心10 min，去除上清液，重复3次，即得红细胞分离液；吸取0.5 ml红细胞于干净的离心管中，标记对应的血样编号。

1.2.5 酶标仪扫描

用0.9%生理盐水将全血及全血分离得到的红细胞稀释60倍，加至96孔板中，用多功能酶标仪扫描全血及红细胞并绘制图谱，统计全血及红细胞吸收光谱的特性；比较正常组与高血脂组激光照射前后全血和红细胞吸收光谱的不同之处，观察吸收峰值的变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 全血与红细胞吸收光谱的特点

在200～1 000 nm波段正常组与高血脂组无论是全血还是红细胞均在200～270 nm范围内吸光度值跳动很大，且随机噪声影响很大，270 nm之后才开始稳定；各自的变化趋势和峰值出现的波长位置基本相同，符合可见光段吸收光谱特征[14]。在（416.47±1.85）、（544.95±1.80）、（578.63±2.00）nm处有明显的吸收峰，正常血样与高血脂血样的吸收光谱仅存在波峰量上的差异；在（345.00±1.00）nm处也存在吸收峰，在600～1 000 nm处其吸收率＜5%，且无特征吸收峰（图1）。由表1可得出高血脂组比正常组的吸收峰要高，以416nm处最为明显。

图1 正常组与高血脂组全血和红细胞的吸收光谱

表1 正常组与高血脂组光谱吸收测量结果（x±s）

2.2 低能量激光照射高血脂血样

用650 nm激光照射高血脂组，激光照射前后的可见光吸收光谱特征无明显变化；照射后的全血光谱吸收峰较照射前高，在吸收峰416、544、578 nm处，照射前后的差异均有统计学意义（P＜0.05）；照射后红细胞光谱吸收峰在416、544、578 nm处较照射前低，且照射前后差异均具有统计学意义（P＜0.05），其中在吸收峰416 nm差异更为突出。（表2）

表2 高血脂组全血与红细胞照射前后光谱吸收变化情况（±s）

表2 高血脂组全血与红细胞照射前后光谱吸收变化情况（±s）

注：与照射前比较，aP＜0.05

项目 组别 n 波长（nm）416 544 578全血 照射前 30 2.64±1.04 1.01±0.37 1.12±0.40照射后 30 3.36±1.11a 1.16±0.35a 1.19±0.36a红细胞 照射前 30 3.85±0.94 1.32±0.20 1.35±0.21照射后 30 3.11±0.91a 1.34±0.37a 1.10±0.28a

2.3 低能量激光照射正常血样

用650 nm激光照射正常组，激光照射前后的可见光吸收光谱特征无明显变化。照射后的全血光谱吸收峰比照射前偏低，但照射前后差异均无统计学意义（P＞0.05）；同时照射后的红细胞光谱吸收峰在416、544、578 nm处较照射前相比，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。由此可见，650 nm低能量激光照射正常血样对血样的吸收光谱并无太大的影响。（表3）

表3 正常组全血与红细胞照射前后光谱吸收变化情况（x±s）

3 讨论

影响血液吸收光谱中可见光吸收峰的主要因素为血红蛋白，国内外相关研究均表明全血与红细胞的吸收光谱基本一致。全血和红细胞分别在波长为345、416、544、578 nm附近存在吸收峰[15]（图1），符合血红蛋白可见光吸收光谱的特征。由于本研究采用的是离体血液，因此血红蛋白处于非氧合状态，表现为非氧合血红蛋白特征。在200～1 000 nm吸收光谱中，峰值为200～275 nm之间很容易破坏蛋白分子，导致血红蛋白失去活性，因此在此波段光谱吸收跳动很大；而当激光波长超过800 nm就会减少血细胞的载氧能力。据临床经验，波长为630～670 nm的激光治疗效果最好，氦氖弱激光照射通常选用的波长为632.8 nm，此时红细胞的载氧能力强，对于血液流变学的改善效果明显。

本研究证明，可利用血液的吸收光谱特征来反映血脂的异常情况，在全血的吸收光谱中，吸收光谱特征并未改变，而高血脂组比正常组的吸光度偏高，在吸收峰416、544、578 nm附近尤为明显（图1）。对于高血脂组，在300～700 nm间其整体吸收峰偏高，主要是由于其血液中甘油三酯和胆固醇的含量比正常血液中多。王乐新等[16]在对高甘油三酯血清吸收光谱的研究中发现，高甘油三脂血清光谱的吸收率要高于正常血清的吸收率，其主要吸收范围为370～600 nm，最强的吸收峰波长位于416 nm，且在538 nm与575 nm附近有2个较弱的吸收峰，但这2个波峰在正常血清的吸收光谱中并不明显。兰秀风等[17]的研究表明，高胆固醇血清的主要吸收范围为375～600 nm，其吸收率是正常血清的2.2倍，其中最强的吸收峰位于波长416 nm处，在544 nm及578 nm处有2个较弱的吸收峰，这2个吸收峰在正常血清的吸收光谱中亦不明显。因此，根据吸收光谱特征可初步判定血液中的血脂含量是否异常。

本研究中对红细胞进行吸收光谱检测，高血脂组较正常组红细胞的吸收峰要高。红细胞的脂质占其总质量的40%，其中磷脂和游离胆固醇约占其总脂的95%，还有少量的甘油酯和游离脂酸，以分子来计数，红细胞膜中的磷脂和胆固醇相近。胆固醇主要分布在红细胞膜的外层，也有一部分嵌入脂质双层，它具有调节膜流动性的作用，红细胞和血浆之间的脂质分子处于平衡体系，需要膜-浆脂质交换来维持平衡[18]。血脂升高，血浆中胆固醇的浓度即升高，胆固醇就会从高浓度的血浆中流入红细胞脂质层，结果红细胞胆固醇含量升高对其光谱吸收产生了影响，使得高血脂组红细胞的吸收峰偏高。

本研究结果显示，用低能量650 nm激光照射可降低红细胞对光谱的吸收。低能量激光照射高血脂血样，使得红细胞膜表面的脂质分子减少，推测是由于经低能量激光照射，可调节多种与脂质代谢有关酶的活性，促进脂肪细胞释放细胞内的脂质[19]，改善红细胞与血浆的脂质平衡，从而进一步改善了红细胞的变形性和聚集性

4 结论

本研究表明，通过低能量激光照射可降低高血脂血液中红细胞对光谱的吸收，间接反映出激光在治疗高血脂方面的疗效，激光治疗通过减少红细胞表面的脂质分子，进而有助于改善红细胞膜的变形性及流动性等血液流变学。未来尚需对低能量激光照射高血脂症红细胞的形态及功能变化的机理做进一步的研究。

利益冲突 无

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Influence of absorption spectrum with 650 nm low-level laser irradiation on in-vitro hyperlipidemia blood and erythrocyte

Wang Haichen,Wang Hong,Liu Weichao,Lyu Jubao,Sha Hong

Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China

Sha Hong,Email:shahong2000@163.com

Objective To study the effect on absorption spectrum of low-level laser irradiation on hyperlipidemia blood and erythrocyte in vitro.Methods A total of 30 hyperlipidemia blood samples were chosen as the experiment group,and 30 normal blood samples were chosen as the control group.The absorption spectrum of whole blood and erythrocyte in the two groups was measured by multi-wavelength microplate reader and compared. After hyperlipidemia and normal blood samples were irradiated by 650 nm low-level laser,the absorbance of whole blood and erythrocyte was measured,and the results were compared with those of hyperlipidemia and normal blood samples before irradiation.Results The absorption peaks(416,544,578 nm)of whole blood and erythrocyte in the experiment group were higher than those in the control group,which was considered as a diagnostic factor of hyperlipidemia.After low-level laser irradiation,the absorption peaks of erythrocyte at 416,544,and 578 nm in the experiment group decreased with significant differences(P＜0.05),while the absorption peaks of whole blood at 416, 544,and 578 nm in the experiment group were elevated with significant differences(P＜0.05).Conclusions Lowlevel laser irradiation at 650 nm can decrease the hyperlipidemia erythrocyte absorption peaks and improve the balance between erythrocyte membrane and lipid profiles,which proves the feasibility of low-level laser for the treatment of hyperlipidemia from the perspective of spectroscopy.

Low-level laser;Hyperlipidemia;Absorption spectrum;Multifunctional microplate reader

沙洪，Email：shahong2000@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．05．005

国家自然科学基金（81602800，81301288）

2016-07-12）