HPLC法测定生物羊膜浸泡5—氟尿嘧啶药物吸收量

周扬　赵爽　张晨明

[摘要]目的 建立生物羊膜（面积为8mm×10mm）中5-氟尿嘧啶（5-Fu）浓度的HPLC测定法以观察不同浸泡时间生物羊膜浸泡5-Fu药物吸收量。 方法 色谱柱为Diamonsil（钻石）C18（4.6mm×250mm，5?m），流动相为甲醇-水（2︰98），流速为1.0mL/min，紫外检测波长为266nm，生物羊膜吸收液为5-氟尿嘧啶注射液（标示量为10mL；0.25g），吸收后用流动相提取，进样测定。 结果 以5-氟尿嘧啶峰面积为纵坐标，5-氟尿嘧啶浓度为横坐标，5-Fu在2～100?g/mL浓度范围内线性关系良好（r=0.9995），浸泡5min，吸收5-Fu为59.004μg/片，浸泡5min，吸收5-Fu为75.839μg/片。 结论 生物羊膜能够吸附一定量的5-氟尿嘧啶，通过测定羊膜中吸收的5-氟尿嘧啶的量，为临床以及基础合理用药提供依据。

[关键词]高效液相色谱法；5-氟尿嘧啶；生物羊膜

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2016）01-42-03

[Abstract]Objective To establish a HPLC method for determination the concentration of 5-fluorouracil（5-Fu） in biological amniotic membrane （area was 8mm×10mm） to observe the absorption of 5-Fu different soaking time in biological amniotic membrane. Methods Determination was achieved on a Diamonsil （diamonds） C18 （4.6mm×250mm， 5 ?m） with the mobile phase of methanol-water （volume ratio of 2︰98）. The flow rate was 1.0mL/min， the UV detection wavelength was set at 266nm and biological amniotic membrane absorption liquid for 5-Fu injection （mark is 10mL， 0.25g）. The sample was detercted after absorption. Results Ordinate was 5-Fu peak area and abscissa was the concentration of 5-Fu. The linear relationship of 5-Fu in 2-100 ?g/mL concentration range was good （r=0.999 5）. 5min immersion， absorbing 5-FU for 59.004μg/piece， soak 5 minutes， absorbing 5-FU for 75.839μg/piece. Conclusion Biological amniotic membrane can absorb a certain amount of 5-FU.By determinating amount of 5-FU absorbed in the amniotic membrane， provide the basis for clinical and rational use of drugs.

[Key words] High performance liquid chromatography； 5-FU； Biological amniotic membrane

羊膜来源于胚胎。由于没有人体白细胞抗原的表达，其抗原性很低，无血管、神经和淋巴管。羊膜上皮细胞具有分化的潜能，在特定条件下可分毛囊上皮和皮肤上皮，对促进上皮愈合和降低基质炎症及溃疡发挥作用[1-3]。

5-氟尿嘧啶是一种抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶、阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷酸，干扰DNA的合成，此外尚能抑制RNA的形成。5-氟尿嘧啶通过无特异性地抑制细胞，减少滤过道瘢痕形成，从而抑制成纤维细胞增生，有利于功能性滤过泡的形成和保持，使术后眼压保持较好，提高手术成功率而用于青光眼手术[4]。5-氟尿嘧啶对角、结膜细胞有毒性作用，可导致泪膜功能明显受损，表现为泪液分泌量减少，泪膜稳

定性下降，易患干眼症。因此在使用时要正确掌握用药适应证、严格控制安全使用剂量。本实验通过将羊膜在5-氟尿嘧啶注射液中浸泡，采用高效液相方法对羊膜吸收的5-氟尿嘧啶含量进行测定[5]。

1 仪器与药品

Waters高效液相色谱仪（Waters2695）KFP-486GE/F，Empower工作站，Waters2996紫外检测器，干燥器，梅特勒-托利多AX205 Delta Range 电子天平（瑞士梅特勒公司），XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

5-氟尿嘧啶标准品（批号：08052897），5-Fu注射液（标示量为10mL；0.25g，上海旭东海普药业有限公司），生物羊膜（江西瑞济生物工程技术有限公司），甲醇为色谱纯（批号：LOT H02E73，美国J.T.Baker公司），水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil（钻石）C18色谱柱（5?m，4.6mm×250mm）；流动相：甲醇-水（2︰98）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20?L；检测波长：266nm。色谱图见图1。

2.2 标准溶液的制备

精密称量5-氟尿嘧啶标准品0.0103g，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度得1mg/mL母液。然后从中精密量取1mL置于另一10mL容量瓶中，用流动相（甲醇-水2︰98）稀释至刻度，得100?g/mL标准溶液。

2.3 标准曲线的制备

取标准溶液用流动相稀释，分别配置2，5，10，20，50，100?g/mL标准品系列溶液，分别进样20?L，连续进样5次。以5-氟尿嘧啶的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，得直线方程为Y=6.37×104X+3.59×104，r=0.9995。表明5-氟尿嘧啶在2～100?g/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4 精密度实验

取5-氟尿嘧啶对照品，分别制成低、中、高3种不同浓度（5，20，80?g/mL）的对照品溶液，各连续进5次。同样方法做3d，记录5-氟尿嘧啶峰面积，并计算峰面积的RSD%值。见表1。

2.5 样品测定

取生物羊膜（面积为8mm×10mm）放入2mL 5-氟尿嘧啶注射液（标示量为10mL；0.25g）中浸泡，其中生物羊膜的数量为20个，10个浸泡5min，10个浸泡10min。将羊膜取出后，加流动相1.0mL，漩涡混匀2min，离心，取上清液，进样20μL，记录峰面积。记录峰面积带入上述方程中，求得羊膜吸收的量。见表2。

3 讨论

3.1 流动相的选择

根据5-氟尿嘧啶的物理和化学性质（即5-Fu在水中略溶，在乙醇中微溶，在氯仿中几乎不溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中微溶）初步选定流动相为甲醇-水。又以各种体积比的甲醇-水（2︰98，5︰95，10︰90，15︰85，20︰80）进行色谱实验，结果发现，当以2︰98甲醇-水作为流动相时，所得5-氟尿嘧啶的峰形，峰高最佳。故最终选择2︰98的甲醇-水作流动相[6-8]。

3.2 5-氟尿嘧啶的提取

文献报道，对5-氟尿嘧啶的提取应用乙酸乙酯提取，离心取上清液，吹干后复溶[9-10]。本实验发现，当羊膜在注射液中浸泡后，用流动相提取的效果比乙酸乙酯提取的效果好，峰面积更大，故本次试验5-氟尿嘧啶的提取用流动相，此法简便，省时。

3.3 羊膜吸收量与浸泡时间

本实验所得结果，浸泡5min的羊膜吸收5-氟尿嘧啶的量比浸泡10min的羊膜吸收的5-氟尿嘧啶的量少，说明羊膜吸收量与浸泡时间相关。但由于羊膜数量较少，未能计算出精确的比例关系，若想进一步求证，还需较多数量的羊膜进行试验。

3.4 药物复合型羊膜的应用前景

羊膜抗原性甚微[11-12]，同时具有清除炎性细胞，减轻炎症反应和血管化的作用，可以减少创面的瘢痕增生[12-13]。利用羊膜的生物学特点，通过生物工程技术手段，人为改变羊膜特定的结构（去羊膜上皮细胞或改变上皮细胞性质）及成分（吸附特定的药物，使羊膜原有化学成分发生变化），使其在保持羊膜基本生理特性的同时赋予其更多的生物学功能，我们称其为羊膜的生物学改良，过去已经有关于羊膜吸附氧氟沙星等药物的报道[14-15]。 新鲜羊膜通过冷冻干燥技术、钴60辐照灭菌等操作步骤制成生物羊膜，是一种透明的、有一定韧性且无神经、血管和淋巴管的组织，保持了羊膜原有的组织结构、原有的基本化学组成、适用于临床要求的组织韧性和生理pH值、含水量低适于常温长期保存。经过对生物羊膜的超微结构研究发现，羊膜基底膜富含胶原纤维和网状纤维，交织排列成网状，网孔间隙约0.5～15?m[8]，能容纳大量药物 ，可吸附药液作为“药库”，且因胶原降解时间较慢，所以可在较长时间内逐步释放出药物，并维持较长时间，同时维持局部有效药物浓度，成为良好的膜控半定量释药系统。任何微粒大小小于生物羊膜微孔的物质均能被储存其中。我们将生物羊膜置于25g/L 5-Fu溶液中，生物羊膜中也就储存了一定数量的5-Fu，本实验结果也显示，生物羊膜可以吸附一定量的5-Fu，同时羊膜吸收量与浸泡时间相关。因此，我们认为在能够将这种药物复合型的羊膜应用到小梁切除术中，生物羊膜在巩膜瓣下被逐渐的溶解和吸收，储存其中的5-Fu被逐渐的稀释和释放出来，与生物羊膜一起发挥抑制滤过通道细胞增殖的作用，因此可以认为生物羊膜在本研究中起到了“天然缓释装置”的作用。这将大大提高青光眼手术的成功率。

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（收稿日期：2015-10-19）