SLE患者B细胞TNFAIP3、TNIP1基因启动子、增强子活性的研究

郝家辉，李晓岚（昆明医科大学,云南 昆明 650031；昆明医科大学第二附属医院,云南 昆明 650031）

SLE患者B细胞TNFAIP3、TNIP1基因启动子、增强子活性的研究

郝家辉，李晓岚
（昆明医科大学,云南 昆明 650031；昆明医科大学第二附属医院,云南 昆明 650031）

系统性红斑狼疮，TNFAIP3、TNIP1基因，启动子、增强子

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种可累及多系统，多脏器的慢性、炎症性、自身免疫性疾病，其临床表现也是多种多样，该病易产生大量自身抗体和免疫复合物，并常伴有免疫细胞功能亢进。SLE的发病机制复杂，至今仍未完全阐明。SLE多发于女性，特别是育龄期妇女，男女患病率存在明显差异，约为1：9。其发病率及患病率存在种群及地区差异，中国人患病率约为31～70/10万。目前系统性红斑狼疮确切病因尚未阐明，公认是遗传易感性、环境触发因子及性激素共同作用的结果，其中遗传因素在SLE的发病机制中扮演着重要的角色。研究表明，SLE以大量自身抗体产生和免疫复合物广泛沉积为其病理特征，造成机体多个靶组织、器官炎症损伤并表现出相应的多种临床症状和体征。SLE许多临床症状被认为是B细胞介导的免疫反应引起，特别是B细胞的高度活化会针对多种自身的抗原可以产生多种自身的抗体，特别是抗DNA抗体。B淋巴细胞刺激因子家族的异常、自身反应性B淋巴细胞凋亡的异常、B淋巴细胞抗原受体的信号传导失控、共刺激信号的紊乱等B细胞的异常在SLE发生发病中起着相当重要的作用。而B细胞功能的亢进、细胞因子分泌、抗体产生、受体活化后的共同反应会导致T细胞的活化。因此，T、B细胞功能异常，B细胞自身内环境稳定丧失和寿命延长是发生自身免疫应答最为重要的机制。有相关研究证实，不论活动期与稳定期的SLE患者，均会存在克隆性增生和异常活化的B淋巴细胞，B细胞的异常活化可直接影响病情活动，晚期B细胞异常活化是SLE患者不能彻底被治愈与病情复发的重要原因之一。近几年来，全基因组关联研究（Genome-wide association studies，GWAS）以及多项候选基因研究已经证实TNFAIP3和TNIP1是SLE的易感基因。TNFAIP3和TNIP1的功能主要涉及固有免疫，通过对NF-κ B信号通路的负调节抑制B细胞的过度活化和凋亡缺陷，可能在SLE等自身免疫病的发生发展中起到至关重要的作用。

1 TNFAIP3（A20）

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNF α-induced protein 3，TNFAIP3）基因定位于6q23，基因全长15, 869bp，cDNA基因长度为2373bp，共有9个外显子，编码A20蛋白，是一种细胞质锌指蛋白。A20可以抑制肿瘤坏死因子（TNF）受体和Toll样受体（TLR）诱导的核因子kappa-B（NF-κ B）活性以及TNF介导的程序性细胞死亡（PCD），是炎症反应的一个重要的负性调节因子，能有效终止NF-κ B介导的促炎症反应[1]。我们发现，A20缺陷的小鼠可以发生较为严重的炎症反应，并对TNF和脂多糖的刺激较为敏感；A20缺陷的细胞非但不能有效地终止TNF诱导的NF-κ B反应，反而更易导致TNF介导的细胞凋亡的出现。因此，TNFAIP3被认为是一种内源性的可以调控炎症反应的基因，也是可以导致自身免疫性炎症反应形成的重要的候选基因之一。TNFAIP3在炎症调节方面的多种潜在作用至今尚未完全阐明，但似乎是细胞和环境依赖的。例如TNFAIP3的突变/缺失通常与B淋巴细胞的发育相关，提示TNFAIP3在这一细胞类型中的缺失可导致淋巴瘤的发生，可能是因为B细胞中抗细胞凋亡/抑制增殖的NF-κ B信号增强的缘故[2-3]。

2 TNIP1（ABIN1)

TNIP1/ABIN1是TNFAIP3/A20的相互作用蛋白，又称A20结合抑制NF-κ B激活因子(A20-binding inhibitor of NF-κ B activation,ABIN1)，于1999年首次被克隆出来。其mRNA广泛表达在多种组织和细胞，包括淋巴细胞，脾脏，骨骼肌等，在细胞分化、细胞凋亡、炎症反应调节方面具有重要功能。人类TNIP1基因位于染色体5q32-q33.1，长度为51492bp，cDNA基因长度为1911bp，有18个外显子，外显子1为非编码外显子，TNIP1也称为NAF1或ABIN-1。TNIP1蛋白包含四种ABIN同源区域：AHD1,AHD2, AHD3,AHD4,其中AHD1主要作用是可以介导TNIP1与TNFAIP3的结合，AHD2是一个与抑制NF-κ B的功能密切相关的重要的调节区域，迄今为止，还没有关于AHD3和AHD4的相关功能的报道。TNIP1的缺乏对NF-κ B通路的抑制几乎没有影响，但TNIP1的表达是受NF-κ B诱导的，而TNIP1的过表达又反过来抑制TNF对NF-κ B的激活，故TNIP1通过与A20相互作用，在抑制NF-κ B通路中发挥着部分效应，此外，TNIP1不与A20结合也能独立抑制TNF诱导的细胞凋亡[4]。有研究表明A20抑制NF-κ B信号能力的减弱可导致高水平的TNIP1产生，进而下调TNF-a,并在免疫细胞活化、细胞因子信号转导和细胞凋亡等生物学的功能中起到重要作用[5]。近年来发现细胞外信号调节激酶（ERK2）信号通路可参与调控细胞的增殖与分化，抑制凋亡信号的传导。TNIP1过度表达会增加细胞表面CD4分子的表达，从而抑制了ERK2的核转运与活化，阻断ERK2依赖的ELK1转活，可证明TNIP1为ERK2信号通路的衰减基因之一。因此我们可以推断，TNIP1有可能间接调节T、B淋巴细胞的增殖及分化，继而影响SLE的发病情况。

3 TNFAIP3、TNIP1基因多态性与SLE的关系

近几年以来，全基因组关联研究（Genome-wide association studies，GWAS）和大量的候选基因研究均证实表明TNFAIP3位点的多个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）与系统性红斑狼疮密切相关。在欧洲、日本以及中国的汉族人群中研究表明SLE患者的TNIP1基因启动子区的两个SNP rs7708392和rs10036748与SLE易感性显著相关[8-10]；Wang C[11】[7]结果显示TNFAIP3的rs2230926（位于Exon3，为错义突变），rs5029937和rs5029924 （upstream）等位基因及单体型在SLE组中的频率显著高于正常对照（Corrected P=0.012，Corrected P= 0.012，Corrected P=0.030），与SLE呈显著相关，而TNIP1的rs7708392在SLE组中的频率低于正常对照，P=0.02，但校正P=0.39；分层研究发现TNFAIP3基因多态性与多种SLE临床亚型如蝶形红斑、关节炎、血细胞减少和高滴度抗核抗体等相关联；而TNIP1仅与发病年龄呈弱相关。结合同期研究结果[10-12]表明TNFAIP3和TNIP1可能是中国汉族人群SLE的常见易感基因，并对疾病多种临床表型的病理机制有所贡献。Y.Fan等[12]对2011年以前所有GWAs和独立样本的复制研究结果进行meta分析，确定rs2230926与所有种族人群SLE呈显著相关。LeeYH[13]的 meta分 析 结果均 显 示 rs2230926，rs3757173的罕见等位基因与所有人种尤其是欧洲和亚洲人SLE相关，另外还发现rs5029939罕见等位基因与所有人群尤其欧洲人SLE发病风险呈强相关，这与我们的研究结果是吻合的。Lodolce等[7]对非洲裔美国人SLE患者进行病例对照的复制研究，不仅证实了TNFAIP3去泛素化区域（DUB）即编码区2个无义突变多态性，发现A125V变异调节A20蛋白的去泛素化（DUB）活性。Adrianto[18]等用精细基因绘图和基因组重复测序法对不同种族SLE进行研究，得出TNFAIP3的风险单体型并确定了一个TT＞A双核苷酸多态性（一个T缺失，另一个T转换为A）与欧洲人群和韩国人SLE相关。这一变异位于一个高度保守区域，具调控潜力并与核蛋白复合体结合组成亲和力降低的NF-κ B亚单位。而且，与非风险性单体型相比，携带此变异的单体型引起TNFAIP3mRNA 和A20蛋白质的表达减少，因此确定TT＞A变异是导致TNFAIP3和SLE间相关性的一个最有可能的功能性多态性。

综上所述，我们将采用双荧光素酶报告基因系统分别检测SLE患者TNFAIP3和TNIP1基因启动子、增强子活性，以及我们前期研究发现的分别位于TNFAIP3基因上游的SNPs rs5029924，以及TNIP1基因SNP rs7708392和rs10036748对基因下游功能的影响；并应用RNA逆转录病毒的慢病毒表达系统以TNFAIP3 rs2230926、rs5029937、rs5029924和TNIP1 rs7708392、rs10036748共同和（或）独立转染SLE患者B淋巴细胞，检测B细胞活化、增殖、分化及细胞免疫功能的相关指标，对TNFAIP3和TNIP1基因的功能以及在SLE发病中的作用机制进行深入的研究，以期在系统性红斑狼疮的发病机制和免疫病理学研究方面有实质性的突破和创新，为下一步开展基因敲除/敲入狼疮动物模型研究打下坚实的基础。

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R593.24

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：1008-4118（2016）01-0085-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.01.032

2016-01-25