骨硬化蛋白对牙骨质形成的影响及其机制

陈甜 白丁口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院正畸科（四川大学） 成都 610041



骨硬化蛋白对牙骨质形成的影响及其机制

陈甜 白丁
口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院正畸科（四川大学） 成都 610041

［摘要］骨硬化蛋白是一种含有胱氨酸结的分泌型糖蛋白，可通过骨细胞突触传递至骨表面并作用于周围的成骨细胞，从而降低骨的发生发育速度。其机制在于骨硬化蛋白与无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族蛋白竞争性地结合辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6，促进β-连环蛋白磷酸化并降低β-连环蛋白水平，从而抑制成骨细胞的分化及活性。牙骨质为连接牙体和牙周组织间的桥梁，其功能在于维系牙体的稳固和牙周组织的健康。骨硬化蛋白参与并影响牙骨质的发生发育等各种生理性活动，因此进一步深入探讨骨硬化蛋白这一骨形成负性调控因子与牙骨质间的相互作用和机制，将有助于牙骨质相关再生领域的发展。

［关键词］牙骨质；骨硬化蛋白；无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族-β-连环蛋白-信号转导通路；分子机制；矿化组织

牙骨质为连接牙体与牙周组织的桥梁，在解剖结构上属于牙体硬组织的一部分，其功能在于维系牙体的稳固和牙周组织的健康。牙骨质在结构和组成方面与骨组织具有很高的相似性，但其无神经无血管，为人体内一种独特的矿化组织。骨硬化蛋白（sclerostin）是一种由骨细胞分泌的由SOST基因编码的分泌型糖蛋白，可抑制由成骨细胞介导的骨形成作用。SOST基因突变或缺失会导致骨硬化性疾病，出现骨质密度异常增高，譬如骨硬化症和范布凯综合征；本文就骨硬化蛋白与牙骨质间的相关性研究进展作一综述。

1 骨硬化蛋白参与牙骨质的发生发育并影响其形成

1.1骨硬化蛋白参与牙骨质的发生发育

骨硬化蛋白是一种含有胱氨酸结的分泌型糖蛋白，其包含有6个保守的半胱氨酸残基，1个保守的甘氨酸残基，1个用于分泌的信号肽和2个N-糖基化位点［1］。在应力刺激作用下，骨硬化蛋白由成熟的骨细胞分泌，它能通过骨细胞突触传递至骨表面并作用于周围的成骨细胞，从而降低成骨速度［2］。Jäger等［3］运用免疫组织化学技术在人和小鼠的牙骨质细胞中检测到骨硬化蛋白的表达，而且骨硬化蛋白通过细胞突起和细缝连接的方式扩散到牙周膜中。Sawada等［4］发现，牙骨质液通过牙周膜毛细血管扩散到深层的牙骨质中，骨硬化蛋白即可通过此细胞旁路径参与到牙骨质的生理活动中。

Naka等［5］在骨硬化蛋白参与牙胚发生与否的研究中发现，从牙板上皮增厚开始直至帽状期，在切牙牙胚的成牙本质细胞中皆有骨硬化蛋白的表达，其表达量随牙胚发生的进行不断增加并一直延续到出生后细胞分化阶段；在磨牙牙胚，骨硬化蛋白表达于出生后开始分化的成牙本质细胞中。随后，Lehnen等［6］发现在小鼠出生4周后，在其靠近根方的细胞牙骨质中存在着骨硬化蛋白的表达，同时在和牙周膜相接的区域有轻度的线性免疫反应，可能代表矿化的成牙骨质细胞和牙骨质细胞；8周龄小鼠的根尖牙骨质细胞中的骨硬化蛋白表达增加。以上研究表明，骨硬化蛋白参与了牙骨质的发生发育过程。

1.2骨硬化蛋白影响牙骨质的形成

当根部牙本质形成时，包绕牙根的上皮根鞘断裂成网状，这时牙囊细胞穿过上皮根鞘进入新形成的牙根牙本质表面并分化为成牙骨质细胞，在牙根表面和牙周膜纤维的周围分泌有机质和胶原纤维。在有关外源性骨硬化蛋白的添加对牙骨质形成的影响的研究中，出现了诸多其影响成骨细胞的结论。Bao等［7］发现骨硬化蛋白会抑制成牙骨质细胞的增殖，增强其程序性死亡，且与骨硬化蛋白呈剂量相关性；其次，骨硬化蛋白可通过抑制核心结合因子-α1（core binding factor α1，CBFA1）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等矿化相关基因的表达来抑制成牙骨质细胞的分化，导致矿化作用的减弱和牙骨质形成的减少；同时骨硬化蛋白作用于骨保护蛋白/核因子-κB受体活化因子配体信号转导通路，加快了牙根吸收的过程。

随着对骨硬化蛋白与牙骨质间相互作用研究的进一步深入，转基因小鼠的构建无疑为更好地探讨疾病形成机制提供了有力的保证。在Kuchler等［8］对Sost基因敲除小鼠牙及牙周表型进行的详细数据统计分析中，舌侧无细胞牙骨质（面积153.2%和宽度160.7%）和有细胞牙骨质（面积164.6%和宽度131.5%）的面积和宽度都明显增加，而颊侧无细胞牙骨质（面积139.57%和宽度119.86%）和有细胞牙骨质（面积132.0%和宽度134.7%）的增量明显较舌侧低，因此Sost基因敲除小鼠表现出无细胞牙骨质和有细胞牙骨质增厚的表型。从组织学角度来看，有细胞牙骨质和骨组织具有更高的相似性，而无细胞牙骨质则是一种相对独特的组织［9-10］，因此无细胞牙骨质的增加值得更多的关注。SOST基因缺失在人体所导致的骨硬化症患者和SOST基因转录轴上增强子进化保守域5功能缺陷所导致的范布凯综合征［11］患者，均表现出牙骨质增多的表型，牙周膜间隙变窄，同时骨硬化症患者出现拔牙困难。

2　骨硬化蛋白影响牙骨质生成的作用机制

经典无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族（wingless-type mice mammary tumour virus integration site family，WNT）信号转导通路通过参与更新干细胞、刺激前成骨细胞复制以及抑制破骨细胞活性和骨细胞程序性死亡等过程促进骨质的形成［12］；骨硬化蛋白作为WNT/β-连环蛋白信号转导通路的胞外抑制剂，与WNT蛋白竞争性地结合辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）5/6促进β-连环蛋白磷酸化，降低细胞质内β-连环蛋白水平，下调相应的靶基因，抑制成骨细胞的分化及活性，是应力刺激下骨重塑过程中不可缺少的成员之一［13-14］。Sost基因敲除小鼠通过WNT/ β-连环蛋白信号转导通路稳定β-连环蛋白表达来增加成骨细胞数量，从而加速骨缺损愈合［15］。智慧蛋白（Wise）的氨基酸组成与骨硬化蛋白具有很高的相似性，同样能够通过与LRP5基因的交互作用［16］对WNT/β-连环蛋白信号转导通路产生抑制，Wise基因敲除小鼠在出生后1.5个月即表现出全身性骨密度增加的表型。在Sost基因敲除小鼠和患有SOST基因缺失相关性疾病的人群中，可以观察到牙骨质增多。作为相似性极高的两种硬组织，骨硬化蛋白是否也能通过作用于WNT/β-连环蛋白信号转导通路来影响牙骨质的形成及代谢呢？

2.1骨硬化蛋白与WNT/β-连环蛋白信号转导通路在牙骨质形成中的作用

2.1.1WNT/β-连环蛋白信号转导通路与牙骨质形成Zhang等［17］运用β-连环蛋白缺陷的转基因小鼠证实，WNT/β-连环蛋白信号转导通路的抑制影响成牙骨质细胞的分化。他们在采用免疫杂交技术追踪成牙骨质细胞特异性标志物BSP的表达中发现，在小鼠出生后15～45 d，Bsp基因表达缺失，其牙根形态出现缺陷和变异。Kim等［18］运用胶原蛋白（collagen，Col）-1α1-Cre：Catnb+/lox（ex3）转基因小鼠发现在无细胞牙骨质中，Bsp、牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）1和成纤维细胞生长因子-23基因表达下降，细胞牙骨质中Opn基因表达下降。构建Ocn-Cre：Catnblox（ex3）/+转基因小鼠模型使其牙源性间质中β-连环蛋白表达稳定，突变小鼠牙根表面形成大量的含有牙骨质细胞的牙骨质［19-20］。此外，作为成牙骨质细胞的前体细胞，牙囊细胞在向成牙骨质和成骨细胞分化的过程中也受到WNT/β-连环蛋白信号转导通路的正向调节作用［21-22］。

WNT/β-连环蛋白信号转导通路对于牙骨质形成的调节还具有多样性。Nemoto等［23］在研究中发现：WNT/β-连环蛋白信号转导通路在抑制成牙骨质细胞分化的同时促进其增殖，这一过程是通过WNT3a抑制CBFA1和成骨细胞特异性转录因子（osterix，OSX）基因表达来实现的；而WNT/β-连环蛋白信号转导通路经典胞外抑制剂细胞外蛋白（dickkopf，DKK）1，可以减弱其对成牙骨质细胞分化的抑制作用，同时WNT3a在其促进成牙骨质细胞增殖的过程中伴随着细胞周期蛋白D1的增加。该研究表明，WNT/β-连环蛋白信号转导通路对细胞分化的负性调节作用可能与细胞处于不同分化阶段有关。以上的研究结果充分证实，WNT/β-连环蛋白信号转导通路在牙骨质形成过程中发挥着的重要作用。

2.1.2WNT/β-连环蛋白信号转导通路影响牙骨质形成的作用机制Han等［24］在牙周缺损处局部注射骨硬化蛋白抗体以持续激活WNT/β-连环蛋白信号转导通路发现，在牙周缺损处有大量细胞性牙骨质生成并附着有排列规则的牙周纤维。他们还通过免疫组织化学和免疫共杂交方法追踪发现，WNT3a、β-连环蛋白和轴抑制基因2的表达在激活组都出现了明显的增高，在新生成组织中也可检测到人牙骨质蛋白1和牙骨质附着蛋白等牙骨质特异性蛋白的强烈表达。与此同时，Sevetson等［25］证实在人骨肉瘤细胞系SAOS-2中，OSX和CBFA1能够促进SOST基因的表达；在临近SOST启动子的上游有含有E-boxes、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein，C/EBP）和CBFA1的结合位点，该元件是SOST基因转录活性所必需的。Yang等［26］发现，SOST同样是成骨转录因子OSX的靶基因，OSX的C末端通过结合到GC区促进SOST启动子活性。

笔者以为在成牙骨质细胞中，WNT3a通过抑制CBFA1和OSX基因表达从而间接性地抑制SOST基因表达，而SOST基因表达的下调促进了牙骨质的形成，即启动了牙骨质的增殖而抑制了其分化过程。也有研究［11］以为，牙骨质细胞分泌的骨硬化蛋白对成牙骨质细胞增殖与分化具有负反馈调节作用。笔者还以为：可分泌骨硬化蛋白的细胞具有相同的细胞来源以及形态、功能和矿化机制；类比软骨细胞受WNT/β-连环蛋白信号转导通路调节方式，WNT/β-连环蛋白信号转导通路在初始阶段对抗成牙骨质细胞的分化，当细胞选择了向牙骨质分化后，WNT/β-连环蛋白信号转导通路又会促进其分化，同时加速牙骨质细胞的成熟；但骨硬化蛋白是否对不同分化阶段的牙骨质细胞产生不同的调节，还需要进一步试验的证实。

2.2骨硬化蛋白与WNT/β-连环蛋白信号转导通路在牙骨质基质矿化中的作用

2.2.1WNT/β-连环蛋白信号转导通路与牙骨质基质形成参与牙硬组织形成的无机盐离子，也可通过WNT/β-连环蛋白信号转导通路影响牙骨质基质的形成。Fatherazi等［27］发现，细胞外无机磷酸盐（extracellular inorganic phosphate，ePi）可促进小鼠成牙骨质细胞系的成牙骨质相关基因及蛋白的表达。Rutherford等［28］在用5 mmol·L¯1的ePi对成牙骨质细胞进行48 h的处理后发现，多种与WNT/β-连环蛋白信号转导通路相关的基因皆出现了不同程度的变化，其中经典WNT/β-连环蛋白信号转导通路中的分泌型阻断剂分泌型卷曲相关蛋白4表达上调，而另一与此相关的阻滞剂WNT抑制因子1却表达下降；WNT4和WNT10b这两种与WNT/β-连环蛋白信号转导通路相关的基因表达则伴随着DKK3表达水平的降低而下调。Fatherazi等［27］运用相同手段对永生性小鼠成牙骨质细胞系（OCCM-30）进行处理发现，Dmp1、Opn、锚蛋白和前列腺亮氨酸拉链基因1表达上调，而Bsp、Ocn、Col1和组织非特异性碱性磷酸酶表达下降。这些研究数据表明，磷酸盐与WNT/β-连环蛋白信号转导通路之间的关系在牙骨质形成和矿化过程中显得尤为复杂。

2.2.2WNT/β-连环蛋白信号转导通路影响牙骨质基质形成的机制 骨硬化蛋白同样可通过WNT/β-连环蛋白信号转导通路参与骨基质中矿物质的调节。Kogawa等［29］发现在人hOCy和小鼠MLO-Y4细胞系中，外源性的骨硬化蛋白可加速钙离子和磷酸盐的释放，导致胞质内外pH值下调，碳酸脱水酶及一系列与骨吸收相关的基因表达升高。在研究相关通路受体作用时，沉默LRP5/6基因表达，可以观察到与骨吸收相关的基因表达剧烈下调，从而表明SOST通过WNT/β-连环蛋白信号转导通路参与骨溶解过程。Ryan等［30］用Sost基因敲除小鼠模型证实，环前列腺素在WNT/β-连环蛋白信号转导通路持续激活的状态下，通过作用于淋巴细胞样增强因子1增强成骨细胞基质的矿化。Li等［31］证实在成骨细胞中加入外源性色素上皮衍生因子，可通过剧烈下调SOST基因表达来增强成骨细胞的分化和基质的矿化过程。其中WNT/β-连环蛋白信号转导通路胞内复合体激活，磷酸化β-连环蛋白表达增强，下游转录因子CBFA1表达增强。

在Sost基因敲除小鼠中，可观察到牙骨质增多伴牙骨质基质矿化增加［8］，据此可提出以下猜想：影响牙骨质基质矿化的相关作用因子ePi，可能使WNT/β-连环蛋白信号转导通路分泌型阻断剂骨硬化蛋白的表达提高，骨硬化蛋白通过WNT/β-连环蛋白信号转导通路受体LRP5/6阻断胞内β-连环蛋白的磷酸化过程，从而抑制牙骨质基质的矿化；而不同的WNT/β-连环蛋白信号转导通路配体，如WNT4、WNT10b或许与SOST表达存在一定相关性。

3　小结

目前，业界尚无对骨硬化蛋白影响牙骨质发育及再生的相关分子机制进行深入的研究，作为WNT/β-连环蛋白信号转导通路的胞外抑制剂，骨硬化蛋白怎样通过WNT/β-连环蛋白信号转导通路抑制牙骨质的生成还需要进一步研究。现有的文献表明，骨硬化蛋白参与并影响牙骨质的各种生理性活动，而作为牙周组织重要组成部分的牙骨质，其重要性不仅体现在牙周再生，同时在正畸牙移动过程中减少牙根吸收等方面也具有重要的科研价值；因此，进一步深入探讨骨硬化蛋白这一骨形成负性调控因子与牙骨质相互作用的机制，将有助于牙骨质相关再生领域的发展。

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（本文采编王晴）

Effect of sclerostin on cementogenesis and its mechanism

Chen Tian，Bai Ding.（State Key Laboratory of Oral Diseases，Dept.of Orthodontics，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（11172190，81371171） and the Doctoral Program Foundation of Institution of Higher Education of China（20130181110013）.

［Abstract］Sclerostin，a secreted glycoprotein with a C-terminal cysteine knot-like domain protein，is produced by the osteocytes and has anti-anabolic effects on bone formation.Sclerostin is an antagonist of Wnt signaling pathway by binding to low density lipoprotein receptor-related protein-5/6 receptors and prompting the phosphorylation of β-catenin.Cementum is a specialized substance covering the root of a tooth and a dynamic entity within the periodontium sustaining the firmness of the tooth.Sclerostin has been identified during cementogenesis，in which the underlying mechanism is still obscure.On this basis，providing a comprehensive insight into the interactional and reciprocal molecular mechanism between sclerostin and cementum may facilitate cementogenesis-related tooth development and regeneration.

［Key words］cementum；sclerostin；wingless-type mice mammary tumour virus integration site family-β-catenin-signal transduction pathway；molecular mechanism；mineralized tissues

［收稿日期］2015-07-10；［修回日期］2016-01-15

［基金项目］国家自然科学基金（11172190，81371171）；高等学校博士学科专项科研基金（20130181110013）

［作者简介］陈甜，硕士，Email：chentian0629@qq.com

［通信作者］白丁，教授，博士，Email：baiding@scu.edu.cn

［中图分类号］Q 51

［文献标志码］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.018