功能性蛋白口服制剂的研究进展

陈玉雪, 杨 亮,张凡庆,朱建国**(. 上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 0040；. 上海富朗特动物保健有限公司,上海,050)



功能性蛋白口服制剂的研究进展

陈玉雪1,2*, 杨 亮2,张凡庆1,朱建国1**
(1. 上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240；2. 上海富朗特动物保健有限公司,上海,201502)

摘 要：随着功能性蛋白应用的愈发广泛，口服给药途径以其方便、安全、高顺应性等优点成为当下提高生物利用率的研究热点。本文结合文献，对常用的口服给药系统，包括化学修饰、功能改善及运送载体等进行简要综述。

关键词：口服给药；功能性蛋白

伴随着生物技术日新月异的发展，越来越多的具有生理活性的多肽或蛋白分子被发现，使得功能性蛋白在现代疾病预防和治疗中逐渐占据重要位置。同时利用转基因动、植物实现了活性蛋白的批量生产，使得针对功能性蛋白给药系统的研究愈发深入。功能性蛋白具有体内作用明确、药理作用强、免疫源性低、毒副作用小等优点，但与传统合成药物相比，蛋白多肽类药物，稳定性差、易变，在体内半衰期短，分子量大，对pH及体内酶变化敏感，难以穿透机体对其形成的天然屏障，化学和构象不稳定等问题极大地限制其应用范围。如何提高功能性蛋白的生物利用率，提高稳定性，改变其给药途径成为这类药物制剂研究的关键问题。

在众多给药途径中，口服给药系统以其较高的生物利用率、用药顺应性及安全型备受研究开发者的青睐，成为当前生物技术药物最热门的研究方向之一。目前已有少量生物技术类药物上市应用，如：口服干扰素、胸腺肽、胰岛素等。现常用功能性蛋白口服制剂的制备方式主要有以下三种：(1)化学修饰；(2)功能改善；(3)运送载体。本文结合相关文献，主要对常用的口服给药系统的制备工艺及优缺点进行简单总结。

1 化学修饰

蛋白质的化学修饰包括主链结构和侧链基团修饰两种，目前针对改变侧链基团的研究较多。通过化学修饰，可有效降低或消除免疫原性，减少药物分子的毒副作用，提高功能性蛋白的稳定性，同时增加跨膜渗透性，提高生物利用率、延长循环半衰期等。

常用的化学修饰方法有：氨基酸替换、环化、乙酰化、PEG化等。在右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG等众多修饰剂中，以PEG类修饰剂最为常用[1]。PEG类修饰剂相较于其他修饰剂，它毒性小、无抗原性、具备良好的两亲性，且该聚合物具有得到FAD认证的生物相容性。1990年，PEG修饰的腺苷脱氨基酶成为通过FDA认证的第一种修饰蛋白。PEG化后的药物分子量增大，从而避免了肾小球过滤；亲水性增加，减少蛋白水解酶对其降解，提高稳定性；与药物间形成化学键合，水解过程达到缓释效果。

虽然目前已有多种PEG化功能性蛋白进入市场，但传统的化学修饰方式存在修饰剂聚合度不一、选择性不够高，修饰后的药物分子量分布宽，改性或降低其生物活性、稳定性低于理想值等突出问题。化学修饰仍需依靠综合性修饰剂的制备、修饰条件的探索来提高其可行性。

2 功能改善

2.1 吸收促进剂

吸收促进剂是指具有可逆、特异或非特异性的，增强胃肠道对功能性蛋白吸收作用的一种小分子化合物，通过促进剂的使用，可提高血液中药物的浓度和生物利用率。

吸收促进剂主要利用以下几种作用机理：① 扰乱细胞膜上的磷脂层，达到增强细胞膜的流动性、降低黏膜层粘度效果，形成细胞膜孔，提高细胞膜的通透性。② 抑制蛋白水解，提高药物稳定性；③增加靶部位单位时间的血流量，提高细胞膜内外药物浓度梯度；④ 促进剂的阳离子与膜表面的阴离子结合，增加黏附能力，促进吸收，提高生物利用率等。

不同理化性质的天然或合成的辅料都具有促进药物吸收的作用，常用的吸收促进剂有：生物粘附性高分子聚合物、脂肪酸及其衍生物、表面活性剂等。近年来的研究热点集中于壳聚糖及其衍生物。壳聚糖、卡波姆等本身就是无毒性药用辅料[2]，在功能性蛋白研究中主要应用其生物黏附性及促吸收作用，研究证明壳聚糖及其衍生物的促吸收作用优于卡波姆，效果较明显。吸收促进剂的选择应遵循理化性质合理、可逆；少毒或无毒无副作用；可循环再生；作用部位明确；价廉易得等原则。但研究发现，使用过程中促吸收机理亦是毒性反应的机理，在促进胃肠道吸收功能性蛋白的同时，也有可能促进肠道内对毒素和病原体的吸收。促吸收剂用法用量的偏差都会造成机体局部或全身性的毒性反应。如钙离子螯合剂可导致细胞中钙离子枯竭，破坏细胞的肌动蛋白丝，降低细胞间的粘附力[3]。

虽然对口服制剂中吸收促进剂已有一定程度的研究，但临床应用还处于初级阶段，无论促进剂的促进机理如何复杂，“安全、高效”将作为吸收促进剂选用的唯一准则。

2.2 酶抑制剂

胃肠道酶的降解作用是功能性蛋白口服生物利用率低下的主要原因，功能性蛋白与其代谢酶抑制剂一起使用，能显著降低或者抑制代谢酶的活性，有利于促进功能性蛋白生物利用率的提高。常用的代谢酶抑制剂有：抑肽酶、Bowman-Birk抑制剂[4]、大豆胰抑制酶、杆菌肽及肝胆酸钠和卡默斯塔甲磺酸盐等。

不同于吸收促进剂，酶抑制剂的特异性要求功能性蛋白和酶抑制剂必须同时到达代谢部位，往往需要将酶与功能性蛋白共同包裹制成微囊、微球、纳米粒等聚合物，Lee 等[5]选用肠溶材料EudraigitL 100制成了胰岛素微球，并分别加入胰蛋白酶抑制剂、凝乳蛋白酶酶抑制剂、Bowman-Birk酶抑制剂，与胰岛素包裹于上述微球体系中。大鼠给予上述微球后，抑酶谱范围更广的抑肽酶Bowman-Birk酶抑制剂，比对照组(未添加酶抑制剂的胰岛素微球)降糖作用增加50 %以上，差异明显；而胰蛋白酶抑制剂、凝乳蛋白酶抑制剂实验组与对照组相比，无明显差异。实验说明酶抑制剂有利于功能性蛋白生物利用率的提高，但抑酶作用强弱，促吸收作用显著与否取决于酶抑制谱的范围。

酶抑制剂和功能性蛋白共同服用，能显著提高功能性蛋白生物利用率，但动物体内研究结果也证明了，酶抑制剂的使用也存在许多不良反应[6,7]。酶抑制剂影响了胃肠道对正常营养性蛋白的消化吸收，同时反馈调节也刺激了酶的分泌，长期使用易导致脾脏肥大增生，过量使用会造成机体多系统产生毒性反应。因此，在新药物控释系统及剂型的研发中，如何限定抑制剂不被释放从而降低其毒副作用，是亟需解决的问题。

3 运送载体

运送载体亦可称为微粒载体。微粒载体可同时满足保护功能性蛋白在消化道剧烈环境中免受酶系统的降解，提高药物在黏膜上皮的透过效率。目前被广泛应用的有：脂质体、微球及纳米粒等，功能性蛋白制成粒径合适的纳米粒、微球、脂质体，不仅能减少和避免药物口服时的酶解作用，提高生物利用率，还可以起到缓释的作用。

3.1 脂质体

脂质体是将药物包裹在类脂质双分子层的超微型球状载体制剂，根据结构的不同，直径分布几十纳米至数微米不等。脂质体具有：①生物相容性好；②同时兼容包裹亲水性和疏水性药物；③无毒副作用，生物利用率高，免疫原性低；④避免体液对所载药物的稀释、体内酶的分解破坏等优点[8]。常用的制备方法[9]有薄膜分散法、超声波分散法、离子梯度法、逆向蒸发法、溶剂注入法、冷冻干燥法、联合制备法等，针对不同的性质包封药物选择相应的制备方式。顾一珠等[10]利用薄膜分散-超声法制备葛根素脂质体，并进行小鼠灌服测试其相对生物利用率，葛根素脂质体对葛根素的相对生物利用率为168.2 %，改善了葛根素的口服吸收。

尽管有多种制备方法，但脂质体制备目前还存在各种各样的问题，尤其以包封率和稳定性低为突出问题，同时其靶向作用主要集中在肝、肾、脾等器官，对其他组织的靶向性不明显，限制其应用。高压均质机等新型制药设备的出现，在提高脂质体均匀性和稳定性方面起到一定的推动作用，但依然无法完全满足脂质体工业化的需求。

3.2 微球

微球是以清蛋白、聚乳酸等可降解材料制成的，粒径在1 μm～500 μm左右的球形载体给药系统，其中粒径小于500 nm，通常又称为纳米粒。近年来，常应用微球给药系统制备水溶性差、胃肠道渗透率低、口服生物利用率低的药物的口服药[11]。利用可降解材料制备的蛋白控释微球具有高生物利用率、低药物毒副作用、血药浓度恒定、控释及靶向等优点。

常用的微球制备方法有：溶剂提取法、溶剂挥发法、相分离法、喷雾干燥法、超临界流体技术等，应用中多采用溶剂提取法、溶剂挥发法与相分离法，前两者适用于非水溶性药物的包载，而相分离法更适用于包载水溶性药物。黄慧等[12]利用壳聚糖为载体，制成胰岛素微球，灌服小鼠进行降糖测试，血糖最大降幅为50.2 %，而诺和灵中效胰岛素皮下注射降糖血糖最大降幅58.7 %，结果证明壳聚糖胰岛素微球口服制剂对大鼠有降糖效果，且与诺和灵中效胰岛素皮下注射降糖效果无统计学差异。

微球系统的粒径大小是影响其在小肠吸收和体内生物分布的重要因素[13]，粒径越大，包封率和装载量越高；而粒径较小的微球具有更大的比表面积，可有效提高功能性蛋白口服的生物利用率。根据不同疾病类型和病变位点，选择相应载体，制备不同粒径大小的各型微球，可以使微球能迅速达到相应的靶向器官，并在靶部位持续维持有效浓度。

3.3 纳米粒

纳米粒载体属于纳米级微观范畴的药物载体运输系统，通常是指粒径在10 μm～1 000 nm之间，是一类以天然或人工合成的高分子材料为载体的胶体微粒。纳米粒利用空间位阻对包裹的药物进行保护，具有跨越黏膜屏障、改变药物在体内分布的优点；较强的靶向性可以减少某些药物的不良反应；长效的药物浓度维持可达到更佳的治疗效果，同时纳米粒制备材料及方法灵活多样，为功能性蛋白口服给药系统研究提供更多参数条件。

理想的纳米粒应具备[14]：①有较高的载药量，如＞30 %；②具有较高的包封率，如＞80 %；③有适宜的制备及提纯方法；④载体材料具有生物降解性，毒性较低或无毒；⑤具有适宜的粒径和粒形；⑥具有较长的体内循环时间。韩丽娜等[15]采用二次乳化法制备胰岛素/维生素B12修饰透明质酸钠米粒(INS/VB12-HA NP)，以糖尿病模型大鼠降血糖实验评价口服给药体系药效，VB12-1-HA、VB12-2-HA、VB12-3-HA三组在8 h后血糖量分别为初始血糖的(50.47±11.82) %、(62.22±13.25) %、(56.22±8.40) %，而口服胰岛素溶液组的降糖作用为(91.84±2.10) %，证明与口服胰岛素溶液相比，纳米粒组均有显著的降血糖作用。

常规纳米粒口服给药后，大部分纳米粒因不能黏附小肠黏液层而导致停留时间过短，包载药物未能达到完全释放。同时小肠上皮层连接致密、蛋白多肽较高的亲水性，使得胃肠道难以吸收释放药物，从而降低了纳米粒口服制剂的生物利用率。通过提高纳微球的黏膜粘附性和靶向性，可以很好地解决这一难题，主要依靠：改变纳微球的粒径；表面电荷；表面修饰、连接靶分子等方式来提高纳微球的黏膜粘附性、小肠黏膜的通透性和靶向性[16]。Reineke等[17]分别制备了500 nm和1 μm、2 μm、5 μm的聚苯乙烯纳米粒，研究其在肠道的吸收、转运和分布情况，结果显示小肠对不同粒径的纳米粒均有吸收，且粒径越小，其在小肠的吸收越多；带正电荷的纳米粒更易粘附于带负电荷的小肠黏液层，利用纳米粒和小肠黏液层的相互作用来延长药物在小肠的停留时间；亲水性纳米粒更易通过小肠黏液层，且在黏液和血液中稳定，而疏水性纳米粒更容易被细胞摄取，Yuan 等[18]用 PEG 对纳米粒进行表面修饰，结果显示，10 % PEG修饰后，纳米粒通过黏液层量增加，上皮细胞摄取量无明显变化，生物利用率较未修饰纳米粒提高99 %，而20 % PEG修饰纳米粒后，上皮细胞摄取量明显降低，因此纳米粒表面达到合适的亲水-疏水平衡更有利于提高生物利用率。

4 结语

综上所诉，相较于化学修饰、吸收促进剂等功能性制剂添加以及脂质体、微球，纳米粒具有无可比拟的优点，是目前研究较为深入广泛的口服给药载体。但不可否认的是，纳米粒体系复杂，作为口服给药载体的影响因素过多，最佳因素参数组合仍有待确认；且当前蛋白口服给药系统研究仅局限在提高蛋白多肽的口服利用度上，如何达到蛋白进入机体后的控制释放、定点靶位研究相对较少；制作成本高昂等诸多障碍，使得功能性蛋白口服制剂真正完全进入临床应用还需更多数据支持。但随着新材料的发现、制备工艺方法的提高及加工设备的完善化，蛋白口服制剂的发展潜力是无穷的，依然有光明的发展前景。

参考文献：(18篇，略)

中图分类号：S816.79

文献标识码：C

文章编号：1001-0769(2016)04-0085-03

基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目“防治仔猪腹泻的猪源性单链抗体口服制剂研制及应用(沪农科攻字(2015)第1-8号)”及上海市生猪产业技术体系建设项目资助。

*作者简介：陈玉雪(1987- )，女，硕士研究生，主要从事饲料兽药产品质量检验及新产品开发验证，E-mail：chenyuxue934592@163.com。

**通信作者：朱建国，男，教授，博士，博士生导师，主要从事预防兽医学方面的教学和科研工作，Email：zhu_jg@ sjtu.edu.cn。